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美谷分子儀器（上海）有限公司

【打造夢想實驗室】類器官實驗室——并非普通的細胞實驗室

美谷分子儀器

2022.11.25

類器官作為近年來發(fā)展迅速的生物技術，逐漸受到科研及醫(yī)療工作者的關注。區(qū)別于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)模式，類器官通過3D培養(yǎng)的方式，使細胞在發(fā)育過程中能夠同時發(fā)生分化，進而形成具有差異性的細胞結(jié)構。除了科學研究，類器官技術目前已逐步應用到臨床輔助診斷和藥敏藥篩檢測等方面，應用前景值得期待。

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類器官 VS 3D培養(yǎng)細胞

從類器官的定義和來源來說，類器官屬于3D細胞培養(yǎng)物，它包含器官特異性的細胞類型，同時可以表現(xiàn)出器官的空間組織和復制器官的某些功能。然而類器官與3D培養(yǎng)細胞并不能直接畫上等號。即使通過利用分化能力較高的干細胞系或者是癌細胞系進行3D培養(yǎng)，由于細胞系經(jīng)過人為的傳代和馴化，細胞系通過3D培養(yǎng)方式產(chǎn)生的細胞球體往往容易遺失一些原代細胞群具有的特性。因此，使用原代分離的細胞會更容易還原器官細胞群的原始結(jié)構和狀態(tài)。

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搭建類器官實驗室

搭建類器官實驗室，部分可沿用傳統(tǒng)細胞實驗室的設計。類器官實質(zhì)上是通過使用特定的介質(zhì)耗材（比如：Matrigel）進行細胞培養(yǎng)，并加入特定的生長因子使細胞能夠在懸浮且穩(wěn)定的環(huán)境下進行增殖與分化。因此，一般的細胞實驗室的配置（包括：二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜、顯微鏡等）仍然是主要配置。在實驗室的布置上，為了減少室內(nèi)污染，需要對細胞實驗室進行獨立分割，設置緩沖間，并設置傳遞小窗進行樣品和試劑的傳送。

此類操作環(huán)境需要特別注意清潔與整潔，因此在超凈工作臺中還需設置明確的操作分區(qū)，搭配干凈滅菌的設備耗材是最關鍵的配置要點。在超凈工作臺中可大致分為潔凈區(qū)、工作區(qū)和廢料區(qū)；工作區(qū)在出風口的前方，主要是我們進行實驗操作的區(qū)域；潔凈區(qū)在工作區(qū)的左方和前方，用于放置移液器、吸頭等耗材，以及放置樣本和相關試劑、培養(yǎng)基等耗材；廢料區(qū)設置在工作區(qū)右方，用于放置使用過的吸頭、注射器和廢液等。

在這個基礎上，需要考慮到類器官的結(jié)構與常規(guī)培養(yǎng)細胞的不同，類器官往往具有一定的厚度，在成像觀察方面是有一定的難度。因此實驗室內(nèi)除了配置常用的倒置顯微鏡以外，配置具有更清晰的拍攝能力的顯微鏡會更為重要，有條件的實驗室還可考慮配置高通量成像分析系統(tǒng)。

基于類器官3D細胞培養(yǎng)的步驟，類器官實驗室的相關設備配置及注意事項包含以下方面：

細胞收集

主要設備：離心機、倒置顯微鏡、冰箱、液氮罐

類器官可以使用活體液體分離細胞或者組織原代分離的細胞等。如常見的腸道類器官，使用的是小腸分離隱窩細胞進行培養(yǎng)。在獲得樣品后，需要進行前處理操作如下：

（1）細胞離心沉淀：為了保護細胞的活性，減少操作過程引入的機械磨損，離心的過程需要保證低速離心運作，而且低溫離心效果更佳。

（2）細胞觀察與計數(shù)：當細胞分離完成后，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并且對目標細胞進行計數(shù)。

關鍵要點：

1. 低溫操作與存放細胞，避免細胞活性受損。

2. 注意環(huán)境與耗材清潔。

細胞培養(yǎng)

主要設備：二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、單按鍵式移液器、多通道移液器、電動助吸器、渦旋振蕩器、金屬浴

可選設備：培養(yǎng)基成份分析儀、自動化移液系統(tǒng)

類器官細胞培養(yǎng)過程與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方式不同，需要在稀釋細胞懸液后加入融解的Matrigel，并混合均勻以在細胞鋪板后形成半固體液滴。另一方面，為了讓培養(yǎng)細胞產(chǎn)生分化，形成特定的結(jié)構，需要在培養(yǎng)基中加入一定的生長因子輔助。為避免產(chǎn)生細菌污染，細胞的鋪板須在超凈工作臺上工作，并推薦使用單按鍵式移液器進行操作，避免液體倒吸時進入移液腔管產(chǎn)生交叉污染。同時Matrigel較快凝固，需迅速且均一完成加樣，保證每孔的細胞水平基本一致。二氧化碳培養(yǎng)箱需定期進行清潔，推薦具備干熱消毒功能的一體化腔體設計培養(yǎng)箱。

關鍵要點：

1. 在Matrigel混合細胞懸液移液的過程，需要保證移液迅速而且液滴均一。

2. 使用合適的生長因子與培養(yǎng)基進行類器官培養(yǎng)實驗。

3. 注意培養(yǎng)的條件，同時注意培養(yǎng)箱的日常清潔，避免反復打開培養(yǎng)箱。

4. 培養(yǎng)基的成份對于類器官的生長以及對于藥篩實驗會產(chǎn)生影響，有條件的實驗室可考慮通過培養(yǎng)基成份分析儀器或者使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行成份分析。

類器官觀察與檢測

主要設備：高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)、共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡

可選設備：流式細胞儀

類器官的觀察是3D培養(yǎng)關鍵的一步，通過清晰的成像有助于觀察培養(yǎng)的效果。寬場顯微鏡往往因類器官具有一定的厚度而使成像效果不佳，類器官形態(tài)偏暗而且只能夠看到大致輪廓和大小。因此類器官觀察更多使用熒光顯微成像的方式，多色的成像也可用于區(qū)分不同的細胞標志物，從而觀察類器官的細胞分化狀態(tài)。此時為了避免產(chǎn)生重影干擾，使用共聚焦顯微鏡更易于觀察到胞內(nèi)結(jié)構。另一方面，對于一塊細胞板上多孔類器官的觀察，具有高通量掃描的成像分析系統(tǒng)使類器官的觀察更為簡單。

類器官應用與分析

主要設備：移液器、PCR儀、金屬浴、真空濃縮儀、片段分析儀、超聲片段儀、電子天平、離心機、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜、二代測序儀及建庫試劑、CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)

功能性研究：研究特定基因?qū)︻惼鞴俚募毎至雅c分化產(chǎn)生的影響，常見的研究包括：基因組/轉(zhuǎn)錄組學研究，研究細胞形成器官結(jié)構過程中的細胞分化內(nèi)在機制，細胞分群分析等；代謝組與脂質(zhì)組學方面的研究，藥篩研究相關實驗除了從類器官的形態(tài)變化中判斷藥效，也需要通過收集細胞培養(yǎng)液進行分析，從中獲得蛋白質(zhì)與代謝物的變化情況，進一步判斷藥物機制與用藥進展監(jiān)控。

關鍵要點：

1. 對于轉(zhuǎn)錄組分析，細胞的活性往往影響了RNA的完整性，因此在RNA提取步驟的過程中需注意環(huán)境清潔。部分操作過程，比如離心操作，需注意配置溫控功能的離心機進行低溫離心。

2. 對于代謝組與脂質(zhì)組分析，類器官會產(chǎn)生較多的外細胞基質(zhì)，因此需要通過一定的前處理并搭配合適的液相色譜進行純化才可以進一步分析。

丹納赫生命科學關注類器官的研究，提供各類先進設備以及整合的解決方案。

丹納赫生命科學提供類器官研究的相關工具，從類器官模型搭建、成像分析到組學研究方面為科研工作者提供幫助。尤其在藥篩研究和成像分析過程中，其具有優(yōu)勢的產(chǎn)品設備能夠促進研究進程，提供精準分析。

在轉(zhuǎn)化醫(yī)學應用方面，腫瘤治療是類器官的應用方向之一。通過分離患者的癌細胞，誘導分化培養(yǎng)類器官，然后進行相應的用藥處理，能夠有效模擬藥物對腫瘤組織的影響。丹納赫生命科學旗下貝克曼庫爾特的Echo移液工作站的精確移液是進行藥篩實驗的得力助手。Echo系列納升級聲波移液工作站，擁有小體積聲波移液黑科技，能夠精準移取2.5nl到25nl微量液滴流；根據(jù)不斷變化的液體類型、體積或性質(zhì)進行實時調(diào)節(jié)，無需用戶干預；可重復移取復雜的試劑組合或性質(zhì)不一致的試劑。

貝克曼庫爾特Echo系列納升級聲波移液工作站

丹納赫生命科學旗下美谷分子儀器的智能型共聚焦高內(nèi)涵成像與分析平臺，在藥效鑒定、藥毒性篩查和科學研究中提供各種類型類器官模型高通量成像與3D分析。ImageXpress Confocal HT.ai智能型共聚焦高內(nèi)涵成像與分析平臺包含如下特點：優(yōu)質(zhì)3D成像系統(tǒng)，配有7激光8通道光源、轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)、自動化水鏡等，提供快速的高分辨成像；專業(yè)3D分析及AI軟件MetaXpress和IN Carta；專業(yè)自動聚焦系統(tǒng)，適用于孔板、玻片及商業(yè)化和自制類器官等各類板材。

MD ImageXpress Confocal HT.ai

智能型共聚焦高內(nèi)涵成像與分析平臺

專業(yè)的顯微鏡設置與操作往往需要較強的專業(yè)背景與經(jīng)驗。對于初學者，如果對多種不同的成像技術都有應用需求，使用多功能的顯微成像模組會更友好。丹納赫生命科學旗下徠卡顯微系統(tǒng)的MICA 多模態(tài)顯微成像中樞，集多功能于一身。它具有以下特點：快速設置，簡易成像，對實驗新手友好；寬場、共聚焦、Lighting檢測模式快速切換，滿足不同檢測精細度及應用目的需要；多熒光指標同時檢測，接近無延遲的成像效果；可在MICA系統(tǒng)中直接培養(yǎng)并觀察細胞。

Leica MICA 多模態(tài)顯微成像中樞

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