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好文悅讀 | 熱心“腸”動態，空間代謝組學技術助力炎癥性腸炎療法開發新策略

鹿明生物

2022.11.22

炎癥性腸炎（IBD）發生期間激活的髓過氧化物酶(MPO)-鹵化途徑會導致宿主組織損傷并加劇炎癥，而環狀氮氧化物作為MPO抑制劑，具有抗炎和抗氧化活性，然而其在調節與IBD相關的炎癥和損傷的功能與效應機制尚未得到專門研究。

本篇由悉尼大學查爾斯·帕金斯中心的Paul K.Witting教授/課題組在Redox Biology期刊發表的題為 “The nitroxide 4-methoxy-tempo inhibits the pathogenesis of dextran sodium sulfate-stimulated experimental colitis”（IF：10.787）的研究成果，以小鼠（結腸組織）為研究對象，通過空間代謝組學質譜成像等研究技術，全面探究環硝基氧化物MetT對DSS誘導結腸炎的改善作用，并發現其通過抑制氧化損傷，減少單核細胞募集和衰減MPO活性等機制發揮作用，為后續輔助療法開發和應用提供了理論基礎。

研究背景

炎癥性腸炎（IBD）作為一種累及回腸、直腸、結腸的慢性腸道炎癥性疾病。現有研究顯示，IBD患者的髓過氧化物酶（MPO）水平顯著升高并與疾病嚴重程度相關。MPO主要表達在腸道粘膜的浸潤的中性粒細胞之中，能夠消耗過氧化氫（H2O2）進而氧化氯離子（Cl-）產生次氯酸（HOCl）。次氯酸作為一種強大的雙電子氧化劑，能夠破壞組織并在細胞招募中發揮作用，從而促進IBD的氧化應急和炎癥損傷。因此，靶向MPO/ H2O2/鹵化物介導的氧化損傷途徑可能作為調節和治療IBD炎癥的有效策略。

環狀氮氧化物是一類具有抗氧化活性的自由基，表現出超氧化物歧化酶和過氧化氫酶樣活性，從而清除細胞中的反應性氧化劑。此外，環狀氮氧化物作為MPO的底物，也是MPO/ H2O2/鹵化物途徑的有效抑制劑，能夠抑制病理性活性氧（ROS）的積累。前期研究表明，環狀硝基氧化物在動物模型中顯示出與預防胃腸道損傷相關的抗炎和抗氧化活性，并在生物體內也具有良好的耐受性，然而其在調節與IBD相關的炎癥和MPO/ H2O2/鹵化物誘導的損傷的潛力尚未得到專門研究。在本研究中，研究人員對一種環狀硝基氧化物4-甲氧基-TEMPO（MetT）在實驗性IBD模型上的抗氧化和抗炎潛力和效應機制進行深入分析。

研究思路

研究方法

1. 實驗分組

（1）研究材料

野生C57BL/6小鼠（每組 n =6，雌性，8~9周）

正常對照組（V）：10% v/v DMSO+90% v/v磷酸鹽緩沖鹽水
MetT對照組（MetT）：正常對照組通過靜脈注射15 mg/kg MetT
DSS處理組：3% w/v葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理9天
DSS+MetT組：DSS組通過靜脈注射15 mg/kg MetT

（2）生理指標

小鼠體重
臨床評分：基于活動性降低、糞便稠度和直腸出血
細胞浸潤水平：InForm軟件

2.?生化分析

魯米諾氧化水平測定：MPO、HRP 或 Mb組
生化檢測：結腸組織裂解液
促炎因子的酶聯免疫吸附測定（ELISA）：IL-6，IL-10
氧化損傷指標：谷胱甘肽磺酰胺，3-氯酪氨酸，血清脂質過氧化氫（LOOH）

3. 組織染色

多色免疫組化：F4/80，Ly6C，MPO
免疫組化：粘蛋白，3-硝基酪氨酸
TUNEL細胞的免疫熒光染色

4. 檢測技術

質譜成像：空間代謝組學
氧化魯米諾的體內成像：IVIS? SpectrumCT體內成像系統

研究結果

1. MetT改善接受DSS處理的小鼠臨床參數 | 藥物療效

在小鼠體重變化方面，在DSS損傷的第9天，MetT和載體對照中兩組之間沒有顯著的體重變化，而單獨用DSS處理的小鼠體重相對于載體對照組小鼠平均減少14%。在同一時間點，DSS+MetT組相比DSS組的小鼠顯示出體重減輕程度有所顯著減少（8%，p<0.05）。

在結腸炎特征得分方面。載體對照組和MetT組中的小鼠在第9天沒有可測量的臨床評分（圖1b）。DSS組小鼠在第9天的臨床評分增加（p<0.05）。相比之下，與DSS+MetT組小鼠顯示出改善的臨床評分（降低?45%；p<0.05）。在隱窩含量方面，與載體對照組相比，用DSS治療9天的小鼠顯示出隱窩數量（~422）的顯著減少。然而，與從載體對照DSS處理的小鼠獲得的腸道樣本相比，DSS+MetT組中小鼠顯示出顯著更高的隱窩含量（圖1c）。

在杯狀細胞數量方面，與對照組相比，粘蛋白的免疫組化染色結果顯示其DSS組小鼠結腸中顯著減少，而DSS刺激的粘蛋白減少在DSS+MetT組小鼠中明顯有所緩解（圖1d）。另外與對照組小鼠相比，DSS處理組沿橫結腸和降結腸長度的粘蛋白水平顯著降低（下降了約11倍）。相比之下，在DSS+MetT組小鼠中，粘蛋白染色僅減少了約2倍，表明MetT在實驗性結腸炎過程中保留了隱窩和結腸上皮的完整性（圖1e）。

圖1 | MetT可減輕DSS處理小鼠的體重減輕以及臨床和組織病理學參數

2. MetT被機體吸收并定位在結腸中 | 藥物分布

采用質譜成像空間代謝組學技術對來自DSS和DSS+MetT處理的小鼠的新鮮冷凍結腸進行藥物空間分布分析（圖2）。結果顯示MetT親本離子（186 Da，正電荷）定位于接受DSS+MetT的小鼠的結腸組織區域中，而在單獨接受DSS處理的小鼠中基本不存在，表明MetT在小鼠的結腸組織區域中積累。

圖2 | 空間代謝組學檢測MetT在DSS處理小鼠結腸中的空間分布

3. MetT改善DSS誘導的蛋白質氧化修飾 | 抗氧化活性

體外實驗表明，與沒有NaCl相比（?1400輻射度），MPO+NaCl組中顯著增加了HOCl的底物—魯米諾的氧化水平，其發光信號約?3800輻射度（圖3a），并強于辣根過氧化物酶（HRP，低活性）以及肌紅蛋白（Mb，無活性）的信號水平。而在NaCl存在下，滴定硝基氧化物MetT能夠抑制MPO酶活性從而降低了魯米諾氧化水平，并呈現對MetT的劑量依賴性抑制（圖3b，c）。

圖3 | MetT抑制MPO / HOCl介導的魯米諾的氧化水平

在谷胱甘肽磺胺（GSA）水平方面。與對照組相比，DSS處理組小鼠的GSA水平顯著增加，然而DSS+MetT組中的GSA水平與單獨使用DSS相比沒有顯著變化（圖4a）。而與對照組相比，3-氯酪氨酸（3-Cl-Tyr）在DSS處理的小鼠中顯著增加，并且在DSS+MetT小鼠中顯著降低至基線水平以下（圖4b，d和e）。表明硝基氧化物MetT能夠緩解結腸中MPO /HOCl特異性蛋白質損傷，但不能抑制GSA的氧化修飾。在DSS誘導的結腸炎中，循環脂質過氧化氫（LOOH）水平與對照組相比顯著增加了約1.5倍，而在DSS+MetT做中恢復至基線水平，表明MetT在DSS處理組小鼠中被全身吸收并增強整體的抗氧化狀態（圖4c）。

圖4 | MetT降低結腸組織中MPO介導氧化損傷的生物標志物水平

研究進一步驗證MetT在體內減弱HOCl介導的氧化修飾，研究分析不同組別中的魯米諾氧化的生物發光水平。其中，載體對照組小鼠的腹部生物發光很低（總輻射值為?5），而DSS處理組小鼠發光水平為?30。與單獨使用DSS相比，DSS+MetT組小鼠中的腹部生物發光信號降低（p = 0.053; 圖 5a 和 b）。該結果表明MetT能夠抑制MPO介導的氧化活性從而降低MPO/HOCl介導的魯米諾氧化水平。

圖5 | 在對照組，DSS處理組和DSS+MetT組的小鼠中魯米諾氧化的體內生物發光成像

4. MetT改善DSS誘導的結腸炎的免疫細胞浸潤 | 免疫浸潤抑制

與載體組或單獨用MetT處理的小鼠相比，DSS處理組和DSS+MetT組小鼠的總細胞浸潤水平顯著增加，然而MetT給藥顯著降低DSS介導的細胞浸潤程度（圖6a）。總體而言，在DSS誘導的結腸炎過程中，免疫細胞MPO+信號強度顯著增加，并且在MetT給藥后減弱至接近基線水平（圖6b）。而相關性分析表明隱窩完整性與MPO水平呈負相關（p = 0.011，圖6c），表明MPO對隱窩有不利影響，并且MetT對于隱窩完整性的維持可能是通過其對MPO的抑制作用來介導的，從而改善小鼠DSS誘導的免疫細胞趨化性。

圖6 | MetT處理發炎結腸組織中的組織結構和免疫組織化學分析

為了鑒定發炎結腸中浸潤細胞群表型，在結腸粘膜對Ly6C單核細胞（紅色），Ly6G嗜中性粒細胞（橙色）和F4 / 80巨噬細胞（綠色）進行定量。并與MPO共同標記以評估結腸MPO的主要來源。其中單核細胞顯示出最高水平的MPO共染色（分別為圖7a-d，e-h和i-l）。與沒有DSS處理的小鼠相比，DSS誘導的結腸炎導致單核細胞，中性粒細胞和巨噬細胞在募集到發炎的結腸組織中（分別為圖7m，n和o）。在DSS+MetT組中顯著減弱了招募到發炎結腸的單核細胞數量，然而，巨噬細胞和中性粒細胞募集的水平保持不變。這些數據表明，MetT在DSS誘導的結腸炎中改善了免疫細胞浸潤，特別是單核細胞的募集，并且該效應與MPO降低相關，并進一步表明MetT在該動物模型中表現出與抗氧化活性協同作用的抗炎活性。

圖7 | MetT處理發炎結腸組織中的單核細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞與MPO共同標記分析

研究進一步分析MetT在DSS誘導的結腸炎期間是否改變了結腸組織的免疫學特征，在抗炎細胞因子IL-10和促炎細胞因子IL-6的水平水平方面。與對照組相比，DSS組和DSS+MetT組的IL-10顯著下調（圖8a），而IL-6顯著增加（圖8b），表明MetT并沒有明顯影響結腸IL-10和IL-6的水平，其調控作用可能是一種非免疫調節途徑，對MetT的保護作用可能歸因于其抗氧化活性。

圖8 | MetT處理發炎結腸組織中的細胞因子IL-10和IL-6表達水平定量

5. MetT可消除結腸炎中DSS介導的細胞死亡 |?細胞死亡改善

為探究急性結腸炎期間的細胞死亡特征，本文接著通過結腸組織樣品中的TUNEL方法檢測細胞死亡。發現對照組中的結腸TUNEL標記（綠色）很少，而DSS處理的小鼠的結腸中TUNEL標記顯著增加。而與DSS處理組的小鼠相比，DSS+MetT組的小鼠顯示出顯著降低的TUNEL標記水平，并與對照組相當（圖9a和b）。

圖9?|?MetT處理發炎結腸組織中TUNEL的免疫熒光圖像和定量

相關討論

盡管目前缺乏明確IBD的直接病因，但黏膜損傷和上皮損傷先于影響腸道微生物群的炎癥性損傷，導致特征性中性粒細胞浸潤至粘膜下層，隨后通過活化的MPO和生成HOCl從而產生ROS，導致能夠對硫醇，脂質和DNA進行不可逆氧化，最終導致細胞死亡。本研究中觀察到活體動物中DSS +MetT處理的小鼠中MPO介導的魯米諾氧化顯著減弱，以及MPO產生的HOCl的特定標志物—3-Cl-Tyr水平完全消亡，表明MetT能夠直接抑制MPO鹵化活性。本研究中的數據也表明，MetT能夠消除在急性結腸炎模型中氧化應激介導的細胞死亡。與其他環狀硝基氧化物的研究相比，本文深入探討環狀氮氧化物是否在體內抑制MPO活性的重要問題，進一步突出環狀硝基氧化物在體內的抗氧化作用。

本研究還證明了MetT給藥調節免疫細胞在發炎結腸中的各個組織學區域的募集。其中巨噬細胞分布主要局限于固有層，取代了DSS處理的小鼠的隱窩結構。目前尚不清楚 MetT 是否在結腸炎期間直接抑制巨噬細胞對固有層的趨化性，或者 MetT 是否保留了隱窩完整性從而限制了巨噬細胞浸潤。雖然之前的體外報告顯示，在硝基氧化物治療期間中性粒細胞募集減少，但在MetT治療的結腸炎模型中，并沒有觀察到體內中性粒細胞募集的調節。相反，我們報告在MetT治療期間，發炎結腸的單核細胞募集顯著減少。因此，局部MPO鹵化活性的降低也可以歸因于含有MPO的其他白細胞（例如單核細胞）的募集減少。

研究結論

本研究結果發現：

與單獨接受DSS的小鼠相比，用4-甲氧基-TEMPO（MetT）治療的小鼠的體重，臨床評分，粘蛋白水平和隱窩健康狀況等指標顯著改善。基于結腸切片的空間代謝組學質譜成像結果表明MetT在結腸中積累，并通過抑制結腸中的MPO / HOCl活性和氧化等生物標志物的組合顯著改善實驗性結腸炎病程。

MetT還通過促進細胞存活來恢復結腸組織結構，通過一種非免疫調節途徑，抑制免疫細胞滲透到腸道層的程度。基于魯米諾的活體動物小鼠成像也顯示，在用MetT預處理的小鼠中，腹部生物發光顯著衰減，與MPO抑制一致，從而產生對結腸的氧化損傷的衰減。總體而言，硝基氧化物MetT在小鼠中具有良好的耐受性，并有效抑制了DSS刺激的急性結腸炎。

小鹿推薦

結腸炎期間的MPO鹵化途徑激活會導致宿主組織損傷并加劇炎癥。而環狀氮氧化物作為MPO抑制劑，具有強大的抗炎和抗氧化能力。本研究圍繞DSS誘導結腸炎的各類臨床和生化指標，同時也采用了空間代謝組學的技術，全面探究環硝基氧化物MetT對結腸炎的改善作用，并發現其通過抑制氧化損傷，減少單核細胞募集和衰減MPO活性等機制發揮作用。總體而言，該研究突出了環狀氮氧化物的治療潛力，為類似研究提供新穎見解。其嚴謹的實驗思路和詳實的研究結果，值得廣大讀者進行借鑒和參考。

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參考文獻?

1.Chami, Belal et al. “The nitroxide 4-methoxy-tempo inhibits the pathogenesis of dextran sodium sulfate-stimulated experimental colitis.” Redox biology vol. 28 (2020): 101333. doi:10.1016/j.redox.2019.101333

2.?Alex, Philip et al. “Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine DSS and TNBS-induced colitis.” Inflammatory bowel diseases vol. 15,3 (2009): 341-52. doi:10.1002/ibd.20753

3.?Augusto, Ohara et al. “Cyclic nitroxides inhibit the toxicity of nitric oxide-derived oxidants: mechanisms and implications.” Anais da Academia Brasileira de Ciencias vol. 80,1 (2008): 179-89. doi:10.1590/s0001-37652008000100013

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END

Nino|撰文

小久|排版

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