Monocle3單細(xì)胞擬時(shí)序軌跡方法新升級(jí)，還不快來(lái)試試？

創(chuàng)新多組學(xué)技術(shù)服務(wù)

2022.8.16

Monocle3背景簡(jiǎn)述

在外界刺激或者發(fā)育過(guò)程中，不同細(xì)胞的功能會(huì)發(fā)生不同的變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞的表達(dá)量呈現(xiàn)出差異性。根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)情況對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行排序，能夠進(jìn)一步推斷出細(xì)胞發(fā)育的軌跡。

Junyue Cao（曹俊越）等[1]在進(jìn)行小鼠的發(fā)育生物學(xué)研究時(shí)，由于數(shù)據(jù)缺少一些祖先的狀態(tài)，且已知的一些細(xì)胞類型來(lái)自多個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的譜系，因此為了克服這些限制，同時(shí)將擬時(shí)序方法擴(kuò)展到數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，于是開(kāi)發(fā)了以PAGA算法[2]為藍(lán)本的新方法，即Monocle3。該方法因其高效的運(yùn)算速度和美觀的可視化，迅速登上了單細(xì)胞擬時(shí)序分析的舞臺(tái)，并已在《Nature》雜志上發(fā)表。

Monocle3軟件介紹

相比以往熟知的Monocle2，Monocle 3經(jīng)過(guò)了重新設(shè)計(jì)，使之可以用于分析大型、復(fù)雜的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集。Monocle 3的核心算法具有高度可擴(kuò)展性，可以處理數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。軟件主要可以執(zhí)行三類分析：1）對(duì)細(xì)胞聚類、分群和計(jì)數(shù)；2）構(gòu)建單細(xì)胞軌跡；3）差異表達(dá)分析。Monocle 3在R語(yǔ)言（v4.1.0或更高版本）環(huán)境中運(yùn)行，同時(shí)需要R包Bioconductor（v3.14或更高版本）和monocle3（v1.2.7或更高版本）來(lái)訪問(wèn)最新功能。

Monocle3原理介紹

1. 使用UMAP降維

統(tǒng)一流形逼近和投影 (UMAP) 是一種降維技術(shù)，Monocle3首先將數(shù)據(jù)投影到一個(gè)低維空間，基于黎曼幾何和代數(shù)拓?fù)涞乃惴▉?lái)執(zhí)行降維和數(shù)據(jù)可視化。與t-SNE相比，UMAP的可視化更具有競(jìng)爭(zhēng)力，最顯著的是提高了運(yùn)行速度并更好地保存了數(shù)據(jù)的全局結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UMAP的計(jì)算效率顯著地加快了對(duì)小鼠胚胎數(shù)據(jù)的分析。UMAP在大約3個(gè)CPU小時(shí)內(nèi)完成了處理200萬(wàn)個(gè)單元格的數(shù)據(jù)集，而t-SNE花費(fèi)了超過(guò)64個(gè)CPU小時(shí)。當(dāng)然，Monocle3也可以直接導(dǎo)入Seurat的降維結(jié)果進(jìn)行分析。

2. 將細(xì)胞劃分為不連續(xù)的軌跡

細(xì)胞的分化總是具有連續(xù)性和離散性的。當(dāng)數(shù)據(jù)量很大時(shí)，Monocle2可能會(huì)錯(cuò)誤地把本來(lái)不在同一個(gè)軌跡上的細(xì)胞認(rèn)為是在同一個(gè)軌跡上，而PAGA（基于分區(qū)的圖抽象方法，Partition-based graph abstraction）方法則解決了這個(gè)困難。

3. 軌跡圖學(xué)習(xí)

Monocle3在相同的低維空間進(jìn)行軌跡圖學(xué)習(xí)，來(lái)表示細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中可能采取的路徑。對(duì)此，Monocle3使用了一個(gè)基于SimplePPT算法的圖嵌入過(guò)程。另外，Monocle3還有幾點(diǎn)升級(jí)：1）直接在UMAP空間（默認(rèn)為三維的）中繪制軌跡主圖，避免直接處理成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)；2）能夠平滑和細(xì)化主圖以排除小分支，從而消除噪聲分支；3）適用于環(huán)路軌跡，而不要求分化軌跡一定是樹(shù)形結(jié)構(gòu)。

4. 計(jì)算偽時(shí)間

為了計(jì)算細(xì)胞級(jí)別的偽時(shí)間，Monocle3開(kāi)發(fā)了一種適用于具有數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞數(shù)據(jù)集的投影策略。該策略的原理是，以主圖為指導(dǎo)，在所有單元上構(gòu)造一個(gè)圖ψ，然后通過(guò)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞與選擇的一個(gè)根或多個(gè)根的距離作為偽時(shí)間。Monocle3是一個(gè)半監(jiān)督的擬時(shí)序分析，因此需要通過(guò)生物學(xué)背景來(lái)選擇合適的起始點(diǎn)。

5. 識(shí)別表達(dá)基因

為了識(shí)別在發(fā)育軌跡中表達(dá)變化不同的基因，Monocle3運(yùn)用了一種常用于分析空間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。Moran’s I統(tǒng)計(jì)量（莫蘭指數(shù)）是一個(gè)多向和多維空間自相關(guān)的度量。該統(tǒng)計(jì)量通過(guò)最近鄰圖編碼數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的空間關(guān)系，使其特別適合于分析大型單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。Moran指數(shù)的范圍在-1~1之間，0代表此基因沒(méi)有空間共表達(dá)效應(yīng)，1代表此基因在空間距離相近的細(xì)胞中表達(dá)值高度相似，小于0的Moran指數(shù)一般都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Monocle3分析步驟

1. 數(shù)據(jù)導(dǎo)入

首先將Seurat對(duì)象轉(zhuǎn)變成軟件可以識(shí)別的cds對(duì)象。將Seurat對(duì)象拆分成三個(gè)模塊：基因的表達(dá)矩陣（稀疏矩陣）、metadata細(xì)胞屬性信息、基因?qū)傩孕畔ⅰ?/p>

生成對(duì)應(yīng)的三個(gè)模塊數(shù)據(jù)：

data <- GetAssayData(M_3h, assay = ''RNA'', slot = ''counts'') ?#細(xì)胞的表達(dá)矩陣new_pd = M_3h@meta.data #meta信息fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data)) #基因?qū)傩孕畔?/p>

使用三個(gè)模塊數(shù)據(jù)創(chuàng)建cds對(duì)象：

cds <- new_cell_data_set(expression_data=data,cell_metadata=new_pd,gene_metadata= fData)

2. 數(shù)據(jù)預(yù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理包括對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化、去除批次、PCA降維等，并設(shè)置一個(gè)PCA維度（這里設(shè)置為10），可以用plot_pc_variance_explained()函數(shù)來(lái)展示維度。

cds <- preprocess_cds(cds, num_dim = 10)

3. 非線性降維和可視化

一般使用UMAP或t-SNE進(jìn)行非線性降維和可視化。Moncle3更推薦使用UMAP方法，處理單細(xì)胞數(shù)據(jù)更快。

cds <- reduce_dimension(cds,preprocess_method = ''PCA'',reduction_method = ''UMAP'')

4. 聚類分析

聚類分析可以判別哪些細(xì)胞是來(lái)自一個(gè)祖先（一個(gè)發(fā)育軌跡上）。

cds <- cluster_cells(cds)

5. 擬時(shí)序分析

擬時(shí)序分析用來(lái)找出每個(gè)群內(nèi)的細(xì)胞發(fā)育軌跡。利用擬時(shí)序分析的結(jié)果可以繪制擬時(shí)序圖。

cds <- learn_graph(cds) #軌跡推斷plot_cells(cds, color_cells_by = "partition", cell_size = 0.5)

6. 選擇合適的起點(diǎn)

可以通過(guò)算法計(jì)算起始點(diǎn)，也可以通過(guò)手動(dòng)選擇起始點(diǎn)，考慮到生物學(xué)意義，推薦手動(dòng)設(shè)置起點(diǎn)。

cds <- order_cells(cds, root_cells = root.cell) #選擇對(duì)應(yīng)的細(xì)胞群作為起點(diǎn)

7. 下游分析

下游分析包括差異基因分析、單個(gè)基因分析（判斷基因的激活順序）等。

Monocle3結(jié)果展示

圖1 | 擬時(shí)序UMAP圖

圖片說(shuō)明：圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，具有相似狀態(tài)的細(xì)胞被聚到一起，顏色標(biāo)注不同的細(xì)胞群。黑色線條表示分化軌跡。黑色圓圈表示樹(shù)干節(jié)點(diǎn)（branch nodes），表示從這個(gè)點(diǎn)開(kāi)始，細(xì)胞可以有多個(gè)結(jié)局；灰色圓圈表示分化樹(shù)葉節(jié)點(diǎn)（leaf nodes），即細(xì)胞的不同結(jié)局。

圖2 | 擬時(shí)序軌跡圖

圖片說(shuō)明：顏色由紫色到黃色，表示分化的時(shí)間由早及晚。數(shù)字表示分化的過(guò)程，數(shù)字越小，表示分化的時(shí)間越早。另外，如果自己指定的起始點(diǎn)，無(wú)法直接訪問(wèn)到某一部分細(xì)胞，這部分細(xì)胞就有無(wú)窮偽時(shí)間，用灰色表示。

圖3 | 擬時(shí)序基因表達(dá)featureplot圖

圖片說(shuō)明：顏色的深淺表示基因表達(dá)量的高低，灰色部分表示該基因沒(méi)有在這些細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。

圖4 | 擬時(shí)序基因表達(dá)曲線圖

圖片說(shuō)明：每個(gè)點(diǎn)的顏色表示不同的細(xì)胞群，橫軸從左到右表示時(shí)間的早晚。從圖中可以看出基因隨時(shí)間發(fā)展的表達(dá)量變化。

今天我們對(duì)Monocle3的簡(jiǎn)介就到此，不知道您有沒(méi)有g(shù)et到這款好用便捷又快速的軟件呢？有需要的老師趕快試試吧！

參考文獻(xiàn)：

[1] Cao, J., Spielmann, M., Qiu, X. et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature 566, 496-502 (2019).?

https://doi.org/10.1038/s41586-019-0969-x

[2] Wolf, F.A., Hamey, F.K., Plass, M. et al. PAGA: graph abstraction reconciles clustering with trajectory inference through a topology preserving map of single cells. Genome Biol 20, 59(2019).?

https://doi.org/10.1186/s13059-019-1663-x

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