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【知識分享】高效液相（HPLC）色譜柱10大誤解（上）

納譜分析

2022.7.15

在任何領域，通常都存在著“誤解”，這些誤解或一直延續到下一代，這些誤解通常是由于從業人員對實際問題缺乏了解而引起的。本期為您揭開高效液相（HPLC）色譜柱10個最流行的誤解的神秘面紗。

誤解1

HPLC色譜柱不能反轉使用

假。實際上，高效液相色譜（HPLC）色譜柱的填充壓力要比其最大操作壓力高得多（通常是其兩倍）。因此，如果使用適當的溶劑并分配了穩定填充床所需的時間，則填充良好的色譜柱應該能夠在兩個方向上工作。人們可能想使色譜柱沿相反方向流動的一些原因包括：在色譜柱切換中進行反吹操作，用頑固強力吸附的樣品沖洗色譜柱的入口。沖洗捕獲的顆粒以減少壓力積聚。

反相HPLC色譜柱的里也有例外。如果制造商在色譜柱入口處使用了較高孔隙率的玻璃料，則可以通過反轉色譜柱將顆粒從填充床中沖洗掉。在工廠裝填色譜柱時，在色譜柱出口處的篩板孔隙率必須低于色譜柱的最小粒徑。納譜分析色譜柱出口入口使用相同的篩板，可以正向使用，反向沖洗；如果色譜柱填料粒徑為5 μm，一般選用2 μm的篩板，如果色譜柱填料粒徑小于等于3 μm，一般選用0.5 μm的篩板，這樣就不會有填料逸出。

某些制造商為何在色譜柱的入口和出口處有不同的孔隙度？簡單。較高孔隙度的篩板比較低孔隙度的篩板具有更少的堵塞趨勢。0.5 μm的篩板比2 μm的篩板堵塞更快。因此，為防止壓力迅速增加和客戶抱怨，制造商可能在入口處使用寬容度更大的多孔篩板。通常，該色譜柱將用箭頭標記，指示僅應在一個方向上使用它。

備注：反轉HPLC色譜柱之前，最好查閱色譜柱說明書或與色譜柱制造商聯系，以查看色譜柱是否可以反轉。色譜柱反方向沖洗之前，一定要將色譜柱返接，不連接檢測器沖洗一段時間。以防有雜質將流通池堵住。一般情況下，正常色譜柱反方向沖洗后應保持反方向使用。

誤解2

所有C18（L1）色譜柱都相同

假。在HPLC的早期，十八烷基硅烷（最常被稱為ODS或C18相）是最早可用于稱為“反相色譜”的新技術的鍵合固定相之一。它成為了反相色譜的標準相，并被大多數從業者迅速采用。由于制藥業是HPLC的較早采用者，并且監管機構不想加持特定制造商的色譜柱品牌，因此，美國食品藥品管理局（FDA）和美國藥典（USP）開發了一種分類系統，該分類系統為在新藥申請下提交的每種新方法。對于HPLC色譜柱，給定了“ L”標記，并且由于大多數提交物中都使用了C18，因此它變為“ L1”。隨著添加附加相，它們被賦予了自己的“ L”編號（例如，L7 C8，L10 CN，L11苯基等）。

不幸的是，該指定系統被證明是不可靠的，因為使用硅膠作為基礎材料，每個C18色譜柱的合成方法都不相同，并且所得反相色譜柱具有不同的性能。例如，納譜分析ChromCore AQ C18色譜柱采用特殊鍵合和封端工藝，具備適度的硅膠表面覆蓋率和疏水性，是一款能耐100%水相的反相色譜柱；ChromCore AR C18色譜柱采用粒徑高度均一的高純硅膠微球，先進成熟的表面鍵合，無封尾處理，可在低pH條件下免受水解的作用，避免因封尾試劑在酸性條件下易水解而改變C18選擇性的問題，使其在酸性流動相條件下具有更出色的分離性能、穩定性和更長的使用壽命；ChromCore BR C18色譜柱基于在單分散硅膠微球，先對表面硅膠層進行有機雜化處理，再多點鍵合十八烷基和完全封端處理，兼容強堿性和強酸性條件；而ChromCore 120 C18-T色譜柱是一款十八烷基鍵合硅膠色譜柱，采用單分散硅膠微球基球，多點鍵合，完全封端，具備更強的化學穩定性和更高的立體選擇性。這些C18色譜柱均被認為是“ L1”（詳情參見下圖1）。

圖1 納譜分析不同型號的C18色譜柱

誤解3

保護柱不影響分離效果

假。首先，有一個保護柱是個好主意。但是，如果選擇了錯誤的配置或固定相，保護柱的選擇會對分離產生很大影響。請記住，保護柱的目的是保護分析柱免受高度保留的樣品組分，微粒和其他不良物質的污染。保護柱比它保護的分析柱便宜得多。因此，它可以更頻繁地更換，而不是更換更昂貴的分析柱。

理想情況下，選擇的保護柱應具有與分析柱完全相同的固定相。如果該相更具保留性（例如，具有更大的碳載量或為混合模式相），則它可能通過引起保留時間偏移甚至選擇性差異而以有害的方式影響分離。如果該固定相的保持力較弱，則可能會或可能不會引起問題，除非所選的固定相影響了整體選擇性。

為了使保護柱對分離性能的影響最小，必須將保護柱正確地插入流路中。顯然，保護柱插入在進樣器和分析柱之間，但是如果使用過多的連接管（過長或兩個內徑較大），則會發生柱外帶擴展，從而影響整體分離。采用集成保護柱的系統會提供最佳解決方案，其中保護柱實際上與分析柱對接。但是，集成式保護柱通常與盒式色譜柱系統相關聯，這似乎已受到人們的青睞。無論采用哪種配置，保護柱都應能夠輕松卸下并從HPLC系統中更換，而不會影響其操作。

從理論上講，如果保護柱在分析柱上增加了額外的柱長，則應該產生額外的塔板，從而增加色譜分離度。但是，由于前面討論的一些因素，通常添加保護柱不會使分離效果保持最佳狀態，有時甚至會降低分離效果。保護柱的優點是延長了色譜柱的使用壽命，并不一定增加總效率。

納譜分析

保護柱及柱芯

圖2 納譜分析保護柱系列產品（含卡套、柱芯）

誤解4

提高溫度往往有利于分離效果

假。隨著溫度升高，流動相的粘度降低，因此，溶質傳質的速率應增加，從而提供更好的色譜效率。的確如此，但是除了色譜柱效率項（H）之外，溫度還會影響保留因子（k）和選擇性（α）。對這些術語的影響會導致分辨率提高（這是色譜分析中我們真正關心的問題）或有損分辨率。保留時間通常隨溫度升高而降低，因為作為熱力學參數，分析物更喜歡保留在流動相中，并從色譜柱中更快地洗脫出來。但是，不同的化學物種其保留度隨溫度變化的程度可能不同，它們的α值可以改變。另外，高溫會導致低k峰被迅速洗脫，以至于它可以在t0或接近t0時洗脫，即未保留的峰保留時間，因此難以量化。

以圖3為例，該系列色譜圖顯示了在20–90 °C的柱溫下七種止痛藥的分離。可以注意到色譜圖的幾個特征。首先，隨著溫度的升高，所有峰的保留降低，并且峰的確變窄，表明效率提高。其次，相對于最接近的洗脫化合物峰5和6，一種止痛化合物水楊酸隨溫度的保留變化更大。實際上，將溫度從20 °C升高到40 °C后，洗脫順序顛倒了。在30 °C的中間溫度下，水楊酸和峰號6，非那西丁被共洗脫。因此，在這種情況下，高于40 °C的溫度會使整個分離過程的分離時間縮短，但洗脫順序卻開始發生變化。

圖3?

20–90 °C的柱溫下七種止痛藥的分離

當然，在提高溫度下操作的另一個好處是降低了色譜柱的工作壓力，使操作人員可以使用更高的流速或更小的粒徑的填料。

另一個在高溫下能夠導致色譜柱性能問題的因素是流動相的溫差。如果柱子在60°C下操作，但是流動相在室溫流入，那么進入的較冷的流動相就能夠引起峰變形，原因是不同溫度下分析物會趨向在高溫的流動相中。所以建議大家在較高溫度下使用色譜柱的時一定記得預熱流動相。

誤解5

碳載量越高，反相色譜柱就越好

假。談到普通的烷基鍵合相時，這樣的結論看來是對鏈長、載碳量和表面鍵合度等概念有誤解。通常，對一個真正的反相保留機制來說，保留能力取決于被分析分子的相對疏水性，所以保留一般取決于載碳量。載碳量越高，保留能力越強。載碳量一般與鏈長成正比，但并不是必然如此。

典型的色譜硅膠表面，可用于和有機硅烷試劑鍵合反應的硅醇含量在8.0 μmol/m2左右。假設在所有的硅醇基上都能實現單層鍵合，則鏈長越長，載碳量就越大，結果是保留能力與鏈長成正比。短鏈鍵合相（比如C8），如果表面鍵合度相對更高，那么鍵合的碳就會更多，就會導致可能比C18有更加強的保留能力。

此外，一些廠家使用二氯硅烷和三氯硅烷做鍵合試劑，由于聚合反應的發生通常能增加固定相的鍵合率。這種情況下，短鏈聚合鍵合相會比長鏈單體鍵合相的鍵合度高很多。對比單體鍵合相，聚合物鍵合相的鍵合層較厚，有時會引起傳質速度變慢。高載碳量的反相柱更加容易發生相塌陷。對于這些色譜柱，當流動相中有機相比例降到10%以下的時候，疏水固定相之間就會傾向于互相結合（self-associate），而不是處于在極性水溶液中的溶解狀態（即相似相溶）。所以，高碳載量反而可能對反相色譜性能有害，而且保留時間的重現性也不好。

由于篇幅過長，本期分享分為上下兩篇，下期內容，敬請期待，謝謝關注~

色譜柱 /?試用

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