質(zhì)譜成像的模擬組織模型定量

2021.9.17

介紹了一種質(zhì)譜成像定量的模擬組織模型制備方法。在組織勻漿中加入系列已知濃度的分析物標(biāo)準(zhǔn)，將它們分裝到模具中并快速冷凍。模擬組織核冷凍切片后置于有組織切片樣本的同一載玻片上進(jìn)行成像和定量。在這個(gè)過(guò)程中，樣本組織和模擬組織經(jīng)歷了質(zhì)譜成像相同的制備條件。采集成像數(shù)據(jù)后，由已知濃度分析物的每個(gè)模擬組織的平均強(qiáng)度信號(hào)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用來(lái)計(jì)算組織中的目標(biāo)分析物含量。組織模擬樣本建立校正曲線，考慮了基質(zhì)抑制和分析物提取效率的影響。

放射自顯影（QWBA）是廣為使用的獲取藥物組織分布信息的主要方法。然而，生成的分布圖像代表了各成分放射性強(qiáng)度的總和，包括母體藥物、代謝物、降解產(chǎn)物和雜質(zhì)的各種組合，這使得了解生化途徑和機(jī)制受到很大限制。

在過(guò)去十多年中，質(zhì)譜成像在分析藥物組織分布方面顯示出越來(lái)越大的優(yōu)越性，其特點(diǎn)是測(cè)量分子特征的質(zhì)荷比（m/z）和強(qiáng)度，不需要同位素標(biāo)記，可使用有限組織樣本，單個(gè)實(shí)驗(yàn)可同時(shí)得到母體藥物、代謝物和內(nèi)源性分子的組織分布情況。質(zhì)譜成像雖然功能強(qiáng)大，但其定量效果受很多因素的影響。和其它質(zhì)譜分析一樣，如不使用參照標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量的離子強(qiáng)度就不能直接與絕對(duì)量相關(guān)聯(lián)。這是因?yàn)榉治鑫镄盘?hào)強(qiáng)度受到包括萃取效率、電離效率、基質(zhì)抑制等因素的影響。此外，一些獨(dú)特的因素如組織微環(huán)境的完整性、離子化前沒(méi)有色譜或樣品凈化使MALDI質(zhì)譜成像的定量變得更加復(fù)雜。從細(xì)胞水平看，組織是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，相鄰區(qū)域可能由不同類型的細(xì)胞構(gòu)成，他們表達(dá)的分子成分可以有很大差異。

在一些已報(bào)道的MALDI質(zhì)譜成像的藥物定量方法中，描述了在對(duì)照樣本的組織表面點(diǎn)加系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立校正曲線。

第一種方法是把標(biāo)準(zhǔn)品直接加到玻片上的組織基質(zhì)替代物中，需定量的樣本也在玻片上。這個(gè)過(guò)程雖然簡(jiǎn)單，但沒(méi)有考慮組織中待測(cè)物的基質(zhì)抑制和提取效率。
第二種方法是把標(biāo)準(zhǔn)品加到對(duì)照組織切片上，這考慮了基質(zhì)抑制，但忽視了組織中待測(cè)物的提取效率。
第三種方法是GSK的Stephen Castellino小組提出的，用添加已知濃度標(biāo)樣的組織勻漿作為參照標(biāo)準(zhǔn)來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是基質(zhì)抑制和待測(cè)物提取和實(shí)際樣本接近，得到的定量結(jié)果更準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是要精心設(shè)計(jì)的模擬組織制備過(guò)程。

Stephen Castellino小組對(duì)他們最初的方法經(jīng)過(guò)多次改進(jìn)，形成了一種高效的模擬組織制備方法，用于組織中藥物的MALDI質(zhì)譜成像定量（見(jiàn)下圖）。基本過(guò)程是把一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品添加到一系列組織勻漿中，然后把這些加標(biāo)勻漿灌注在模具中冷凍，得到一組含目標(biāo)分析物濃度梯度的組織核。把這些模擬組織塊冷凍切片并融貼在載玻片上，需定量的組織樣本也在同一玻片上，在玻片上施加基質(zhì)和質(zhì)譜成像分析后，得到各加標(biāo)模擬組織切片的平均信號(hào)強(qiáng)度，與已知的標(biāo)準(zhǔn)品濃度關(guān)聯(lián)就得到校準(zhǔn)曲線。這個(gè)校正曲線用于對(duì)切片上的目標(biāo)組織區(qū)域（ROI）定量。

該模擬組織模型的設(shè)計(jì)目標(biāo)是盡可能接近給藥組織的真實(shí)情況，校正分析物提取和離子抑制的差異對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的可能影響。該模型的優(yōu)點(diǎn)之一是靈活設(shè)計(jì)，其中勻漿核的數(shù)量、組織類型、標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量、濃度范圍等都可以按需要調(diào)整。

建立模擬模型的操作步驟包括選取模擬組織和確定樣品量、組織勻漿、準(zhǔn)備模具、配制標(biāo)準(zhǔn)品和勻漿加標(biāo)、制備模擬組織核和模擬組織核切片。按照美國(guó)FDA生物分析方法驗(yàn)證指南，模擬組織模型由六個(gè)濃度水平的加標(biāo)勻漿和一個(gè)用于評(píng)估檢測(cè)能力的非加標(biāo)勻漿。校準(zhǔn)曲線應(yīng)至少有七個(gè)點(diǎn)，包括空白。其它六個(gè)點(diǎn)應(yīng)該均勻分布并覆蓋預(yù)期的濃度范圍。包括空白可以更準(zhǔn)確地評(píng)估檢測(cè)能力，如空白限（LoB）和檢測(cè)限（LoD），提供了電路和化學(xué)噪音和組織基質(zhì)的背景干擾情況。

以上內(nèi)容源自：

1.?A mimetic tissue model for the quantification of drug distributions by MALDI imaging mass spectrometry. Anal Chem. 2013;85(21):10099-106 M. Reid Groseclose,?Stephen Castellino

DOI: https://doi.org/10.1021/ac400892z

2.?Revised Preparation of a Mimetic Tissue Modelfor Quantitative Imaging Mass Spectrometry. Protocol Exchange 24 August 2018. Jeremy A. Barry, M. Reid Groseclose,? Donna D.Fraser, Stephen Castellino

DOI: https://doi.org/10.1038/protex.2018.104

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