史上最全的QPCR數據分析
用參照基因 ( 如GAPDH 或 ?-actin)能準確量化初始材料的載量,尤其當初始材料量常常受限時,進行相對基因表達分析實驗十分方便。缺點是這個方法要求得到一個或多個在所有測試樣本中恒定表達的已知參照基因，而且表達水平不受研究條件下處理方式的影響。確定這樣的參照基因十分重要，最近有報道提出在大多數研究實驗中，使用多個參照基因對于準確定量是必須的。(Vandesompeleet al., Genome Biology 3, research 0034.1–0034.11, 2002 )
用相對定量比較多個樣本，樣本之一常被選為參照。在其它所有樣本中目標基因的表達都相對于參照上調或下調，通常用未處理的或基準樣本作為校準樣本。確定 CT 值之后，可以用不同的方法來確定實驗樣本相對于校準樣本目標基因的相對表達水平，下面我們介紹三種用參照基因進行相對定量的方法：1) Livak 法，即眾所周知的2–ΔΔCT法 2)用參照基因的 ΔCT 法 3 ) Pfaffl 法，每種方法都有優點和缺點，并且必須滿足分析實驗結果的前提條件。
進行相對基因表達分析普遍采用操作簡便的2–ΔΔCT 法，條件是目標基因和參照基因擴增效率都接近 100% 且相互間效率偏差在5% 以內。使用2–ΔΔCT 法之前，必須驗證目標基因和參照基因的擴增效率。一旦確定目標基因和參照基因有相似且接近 100% 的擴增效，你就可以確定不同樣本中目標基因表達水平的相對差異，步驟如下：
首先，對所有的測試樣和校準樣本，用內參基因的 CT 值歸一目標基因的CT 值：
ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref,test)
ΔCT(calibrator) = CT(target,calibrator) – CT(ref, calibrator)
其次，用校準樣本的 ΔCT 值歸一試驗樣本的 ΔCT 值：
ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)
最后，計算表達水平比率：
2–ΔΔCT = 表達量的比值
得到的結果是通過參照基因表達水平校準的試驗樣本中目標基因相對于校準樣本的增加或減少的倍數，用參照基因校準目標基因表達的目的是彌補樣本組織量的差異。如果目標和內參基因的擴增效率不相近，可以優化或重新設計實驗，或者可以采用后面講的Pfaffl 法。另外，如果目標基因和參照基因有同樣的擴增效率，但是擴增效率不等于 2，那么2–ΔΔCT法的公式可以修正為用實際擴增效率值代替等式中的 2。例如，如果目標基因和參照基因的擴增效率都為 1.95，計算公式為1.95–ΔΔCT。
用參照基因的ΔCT 法是 Livak法的一種變化形式，它更容易掌握且結果相同，ΔCT 法用每個樣本中參照基因與目標基因的 CT 值差異。雖然這種方法的操作步驟簡單，但同樣能真實衡量基因表達水平，將參照基因的表達水平計算在內。結果顯示，主要的差異是校準樣本的表達水平不是1.0。如果用這個方法得到的表達值除以所選的校準樣本的表達值，計算結果與2–ΔΔCT法的結果正好相同：
Ratio (reference/target) = 2CT(reference) – CT(target)
這個方法的數學前提與2–ΔΔCT法的相同。
當目標基因和參照基因的擴增效率相近時，用2–ΔΔCT法定量相對基因表達是最合適的方法，但是如果兩個擴增子擴增效率不同，必須選擇另一個方法來確定不同樣本中目標基因的相對表達量。用下列公式確定測試樣和校準樣之間表達比率：
上述等式中，Etarget和 Eref分別是目標基因和參照基因的擴增效率，ΔCTtarget(calibrator – test) 是校準樣本中目標基因的 CT 減去測試樣中目標基因的CT，ΔCT ref(calibrator – test) 是校準樣本中參照基因的 CT 減去試驗樣本中參照基因的CT。上述等式的前提：每個基因 (目標和參照 )在試驗樣本和校準樣本中有相同的擴增效率，但是目標基因和內參基因之間的擴增效率可以不同。
由于生物系統的復雜性，沒有任何一個內參基因對于所有的實驗都是適用的，所以采用經過驗證的兩個及以上內參基因來做歸一化是最適當且普遍適用的方法，即Vandesompele法，公式如下：
Bio-rad CFX Manager軟件中融入了基因表達的各種計算方法，能使定量實驗結果更準確。
