免疫組化技術(shù)規(guī)范（一）
歐美國家相繼開展了免疫組化質(zhì)量控制工作，建立了一套比較完善的質(zhì)量控制方法和程序。中國病理工作者委員會（CCP）免疫組化研究中心借鑒國外的先進經(jīng)驗并結(jié)合我國當前的實際情況開始探索一種適合我國免疫組化質(zhì)控的方法，同時，發(fā)現(xiàn)和推廣標準化的染色程序，改善和提高免疫組化實驗的可靠性，使免疫組化技術(shù)更具標準化，免疫組化結(jié)果更具可靠性和重復性。盡管免疫組化在許多實驗室中已常規(guī)開展，但它是一個多步驟、多因素決定的一種實驗方法，由于各實驗室采用的修復方法、染色方法、試劑廠家、抗體克隆號、檢測系統(tǒng)等有所不同，染色結(jié)果會出現(xiàn)較大差異，相當部分的實驗室對免疫組化標準化的認識尚欠足夠重視, 致使不良的染色結(jié)果對病理診斷引起誤導，因此免疫組化染色結(jié)果的可靠性受到了極大的關注。
在實際工作當中有許多因素影響著免疫組化的結(jié)果，包括技術(shù)人員是否熟練掌握整個實驗的操作程序、抗體的特異性、方法的敏感性、標本的固定、組織的處理、是否進行抗原修復、修復液的PH值等等因素。為了讓每個實驗室能夠持續(xù)穩(wěn)定地完成可靠的實驗染色結(jié)果，應當將免疫組化染色技術(shù)中的全部流程納入標準化。
一、 免疫組化成功的要素
病理科醫(yī)生要有相當?shù)拿庖呓M化診斷知識和免疫組化技術(shù)經(jīng)驗，要清楚認識免疫組化技術(shù)是一門實驗性、技術(shù)性非常強的技術(shù)，要多了解多種抗體在組織中的表達情況，以及影響免疫組化結(jié)果的各種因素，只有提高醫(yī)生的免疫組化診斷水平才能避免錯誤的判斷，才能確保免疫組化診斷的準確性。病理技術(shù)人員是免疫組化實驗成功的關鍵因素，操作人員要有豐富的免疫組化的理論知識及熟練的免疫組化染色技術(shù)，十分清楚每一個步驟的應用原理，使實驗結(jié)果更具可靠性?？煽康膶嶒炘噭┖蛯嶒灧椒ㄊ敲總€實驗室的必備條件。由于實驗方法多種多樣，抗體的品種繁多，每個實驗室都應當確保高質(zhì)量高效價的試劑，并摸索出最佳的實驗條件。優(yōu)質(zhì)的免疫組化取決于有效的抗原修復、敏感的檢測系統(tǒng)、合適的實驗質(zhì)控對照及熟練和有責任心的技術(shù)人員。
二、免疫組化染色前處理技術(shù)操作規(guī)范
1．取材：理想的取材厚度是0.2cm～0.3cm，大多數(shù)實驗室都認為組織在加熱抗原修復過程中造成脫片的主要原因是取材過厚或脫水浸蠟處理不當所致。良好的取材、固定、脫水過程是免疫組化質(zhì)控的前提，如果H&E切片都做不出滿意的染色結(jié)果，那么免疫組化染色也將無從談起，根本無法保證染色質(zhì)量。
2．固定：在眾多的組織固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的實驗方法在使用上各有千秋。但在保持組織細胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測定性、組織滲透性以及試劑的價格上，福爾馬林是最好、既經(jīng)濟又通用。而含酸或含汞的固定液對抗原保存均不理想。組織離體后固定一般不要超過30分鐘，在常溫條件下固定時間為8-24小時。同時還要注意避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原丟失，有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴重，抗原幾乎不能被檢測，因為組織固定后會引起蛋白或蛋白分子之間形成交聯(lián)，導致抗原位點遮蓋，可以通過抗原修復方法來修正，若加抗體前不采用抗原修復，則免疫組化染色常不能到達理想結(jié)果或不成功。組織同樣不能長時間放置在70%的乙醇中，酒精固定后的組織形態(tài)不如福爾馬林固定的組織。脫鈣液對抗原破壞較為嚴重，因此在組織脫鈣前最好在福爾馬林液中固定48小時，若組織沒有固定透則酸會破壞抗原，脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時間都必須盡量控制在最低的限度。
3．浸蠟：我們認為浸蠟溫度應控制在58～60℃左右，浸蠟用的石蠟應經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細胞收縮，更容易掉片。
4．切片厚度：用于免疫組織化學染色的切片厚度為3-4微米。為防止在染色過程中脫片，需要使用硅化玻片裱片。
5．硅化玻片的制備：載玻片經(jīng)酸洗沖洗干凈后烤干； 2%APES丙酮或無水酒精中浸泡1～2min；丙酮或無水酒精洗1～2分鐘；蒸餾水浸洗1～2min；烤干備用。
6．烤片：切片在60℃～65℃烤箱中烤片30－60分鐘左右。有些實驗室采用烤片過夜。有報導烤片溫度超過60℃時，烤片時間超過18小時的切片，免疫組化染色強度比烤4小時的切片要略弱。溫度過高或時間過長均會影響抗原的活性，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。
7．切片保存：一些實驗室研究人員習慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長期保存在室溫條件下，切片后的組織在室溫下長期保存抗原可以損失。邁新實驗室在實驗中發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后，在室溫下保存三個月以上，免疫組化染色結(jié)果會出現(xiàn)減弱或陰性情況。并進行了新、舊切片的保存時間對照實驗，選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片，共110片，常溫空氣中放置一個月、三個月、半年、一年與新切片進行成對對照實驗。實驗結(jié)果表明：組織蠟塊切片后在室溫下保存三個月，抗原對多數(shù)抗體的敏感性約下降一半，部分切片丟失更多。切片保存半年多數(shù)的抗體不能出現(xiàn)陽性標記結(jié)果，保存一年以上僅有個別的切片能夠有微弱的陽性表達，尤其核表達的抗原丟失更為突出。國外也有類似的資料報道。其原因可能與空氣中的氧化作用有關，所以在實際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中實驗的切片更應注意切片的保存。
8．脫蠟：免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實驗室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟徹底，否則可能導致染色結(jié)果的異常。
