酶標儀在植物領域的三種應用總結（三）
3.3 ROS 分析
與氧化應激密切相關的活性氧簇 (Reactive Oxygen Species，ROS) 在植物免疫信號通路中發揮著關鍵的作用，也是常規檢 測的信號事件之一。與哺乳動物細胞的 ROS 水平檢測不同，植物 ROS 信號通常用基于化學發光的魯米諾 (Luminol) 法。Luminol 在氧化環境下 ( 如結合 H2O2 )，結合合適的催化物就會產光 ( 圖十一 )，因此可用于動態追蹤 ROS 的水平，例如探究不同 表達條件下和突變情況下植物在鞭毛蛋白 ?g22 刺激下的 ROS 反應程度 ( 圖十二，Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16(4):48494. ；Mol Cell.2018 Feb 1;69(3):493-504.e6. )。
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圖十一 Luminol 工作原理，圖片來源于網址：https://www.aimsci.com/ros/html/?page_id=285
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圖十二 左，利用 Luminol 法檢測 avrB 的表達對 Flg22 刺激的 ROS 水平的影響，圖片來源于：Cell Host Microbe. 2014 Oct 8;16 (4):484-94.，酶標儀為 SpectraMax L。右，研究突變體對 Flg22 刺激的 ROS 水平的影響，圖片來源于：Mol Cell.2018 Feb 1;69 (3):493-504.e6.，酶標儀為具有化學發光檢測能力的 SpectraMax 系列。
由于 Luminol 反應為快速化學反應體系，因此需要酶標儀配備注射器系統，如 Molecular Devices 的 SpectraMax L， SpectraMax i3x 等 ( 圖十三 )。除了 luminol 法之外，結合試劑盒還可通過光吸收法和熒光法進行植物組織的 H2O2 定量 ( 圖十四， Mol Plant. 2013 Mar;6(2):337-49. )。
圖十三 Luminol 法結果示意圖，數據基于配備注射器的 SpectraMax L，應用快速動力學模式，采樣間隔 1 秒。 圖片來源于文獻：Mol Plant. 2013 Mar;6(2):337-49.。酶標儀為SpectraMax Gemini。
圖十四 基于熒光法 H2O2 定量，分析基因過表達對 H2O2 的影響。
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3.4 基于水母素 (Aequorin) 的鈣信號分析
在哺乳動物和人類細胞中，鈣離子調控幾乎參與了所有核心的細胞信號事件和行為事件，其和磷酸化調控被譽為統治級別的 信號轉導方式。在植物中也不例外，鈣信號是核心的植物生長和發育的調控者，參與了細胞分裂，激素的下游通路和應激反應等 等 (Plant Cell. 2005 Aug;17(8):2142-55.)。在哺乳動物細胞研究中，鈣流通常是基于熒光探針法，然而，在植物中存在多種色素 和自發熒光物質的干擾，因此相關研究會主要基于 Aequorin 法，其主要基于使用過表達的 Aequorin 蛋白。通過三個高親和力位 點結合鈣離子后，在氧的作用下 Aequorin 會不可逆催化 coelenterazine 發出藍光 ( 圖十五，Methods Mol Biol. 2013;1043:4554. )。該反應屬于化學發光，可用支持對應檢測模式的酶標儀進行分析。
圖十五 利用 Aequorin 檢測鈣流原理圖，圖片來源于文獻：Methods Mol Biol. 2013;1043:45-54.
由于鈣離子流動是快反應，因此針對的檢測模式為化學發光快速動力學檢測，因此儀器需有配備有注射器和化學發光檢測能 力，如Flexstation 3，SpectraMax i3x和SpectraMax L等 (圖十六)。
圖十六 上圖，Aequorin 法檢測植物鈣流結果示意圖，數據來源于配備注射器的 SpectraMax i3x。下圖，利 用 Aequorin 法檢測基因突變對 glutamate 刺激的鈣流的影響，突變來源文獻：J Exp Bot. 2016 Mar;67 (6):1853-69.。酶標儀為 Flexstation 3
與常見的熒光法不同，Aequorin 本質為化學發光法，因此避免了由激發光帶來的光損傷影響，同時也不受化合物自發熒光的影 響，具有更低的背景等優勢。
四、利用酶標儀進行植物-微生物相互作用分析
在最后一章中，我們會涉及到植物整體水平的分析，主要關注近幾年興起的植物-微生物相互作用分析。我們會通過兩個案 例向大家介紹酶標儀在這個方向的應用。
第一個案例關注植物，如擬南芥與在植物根上常見的微生物如熒光假單胞菌之間的共生關系。為了確認植物來源的變化是否 會影響共生微生物的適應能力，科學家建立基于 24 孔板的高通量篩選系統 ( Rhizosphere assay 圖十七，Nat Plants. 2015;1 (6). )。在體系中，通過水培將擬南芥種在 24 孔板中的漂浮網盤上，這樣只有根浸入培養基中。再引入標記了 GFP 的細菌，就可 以使用酶標儀進行高通量的微生物增殖分析了( 圖十七 )。由于體系培養基中無碳，因此微生物的增殖需要依靠植物本身的光合產 物。
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圖十七 上圖，Rhizosphere assay 示意圖。左邊放大圖可觀察擬南芥種于漂浮網盤上，右圖為引入微生物 P. ?uorescens 7 天后的照片。 下圖，基于 Rhizosphere assay 篩選 196 株擬南芥的結果。圖片來源于文獻：Nat Plants. 2015;1(6).。酶標儀為 SpectraMax M3。
第二個案例同樣基于 GFP 蛋白的熒光檢測，但是基于檢測真菌對植物的侵染機制。一些真菌的效應蛋白，如大豆疫霉菌的 Avr1b 蛋白可直接將 GFP 蛋白轉入至植物細胞中，這樣就可以通過酶標儀分析靶細胞的熒光檢測霉菌的感染能力和進一步機制研 究 ( 圖十八，Cell. 2010 Jul 23;142(2):284-95. )。在此，為了獲得更具有代表性的熒光信號，我們可使用 Molecular Devices 具有 孔掃描功能的酶標儀進行多點信號的采集和平均。
圖十八 基于熒光法動態分析 A549 細胞對霉菌效應蛋白的攝入。 圖片來源于文獻：Cell. 2010 Jul 23;142(2):284-95. 。酶標儀為 SpectraMax Gemini。
五、總結
上述的案例向我們展示了一些酶標儀在植物領域常見的應用方向。從常規的分子分析、酶活檢測到植物信號的研究等，都可 以應用酶標儀進檢測和分析，在提高通量的同時簡化實驗的流程。
針對植物領域 Molecular Devices 提供了包括硬件和軟件的解決方案。對于常見的光吸收實驗，如紫外法核酸蛋白定量和光 吸收酶活、ELISA 等，我們推薦配備比色皿端口的全波長光吸收酶標儀 SpectraMax Plus 384，其配備了 8 套檢測光路，適合于 高通量光吸收分析。針對熒光檢測，如報告基因和酶活，推薦靈敏的 SepctraMax Gemini 熒光酶標儀。而針對化學發光檢測，如 報告基因，ROS 檢測，則推薦具有高達9個動態檢測數量級的 SpectraMax L，其能配備注射器體系，適用于各種快/慢反應的檢 測。除了單功能外，我們也有支持多個功能檢測的酶標儀平臺，如經典的M系列和新推出的 iD 系列可供選擇。
在軟件上，業內領先的 SoftMax Pro 軟件可輕松應對檢測過程中涉及的分析需求。對于常見的曲線擬合，SoftMax Pro 7 提 供了多達 21 中擬合選擇，并且擬合的方式全部可以自定義，因此可用于多種酶活分析等。對于動力學檢測，SoftMax Pro 可自動 按需求輸出斜率、AUC、最高速度等等。對于光譜掃描，SoftMax Pro 則可自動導出最高吸收峰波長等。只需點擊一次，數據采 集到分析到輸出就可一次完成。
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技術原理
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焦點事件
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