基因帶六個his標(biāo)簽，蛋白純化時為何掛不上鎳柱
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等待高人回答txstbbm(站內(nèi)聯(lián)系TA)可能情況：
1，ORF不完整或者不是預(yù)期的ORF，His沒表達(dá)出來
2，His被空間結(jié)構(gòu)所掩蓋，建議變性后再過柱cloudy3197(站內(nèi)聯(lián)系TA)同一ls，可能跟蛋白空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，變性后再上柱。
2. 柱子是新的還是以前用過的,舊的應(yīng)該很好的處理一下,
3.緩沖液很重要,蛋白與柱子結(jié)合是靠離子螯合,反應(yīng)環(huán)境很重要
好好做好每一步!stella0xhx(站內(nèi)聯(lián)系TA)首先感謝各位的解答啊！不過問題還是沒有解決。那個重組基因是測過序的，沒有內(nèi)含子的，也做過SDS－凝膠蛋白電泳，蛋白表達(dá)正確且可溶性也好，就是做純化，掛不上柱，我想得到的是純化后有活性的蛋白，因為后續(xù)還要做其它的用。所以不能變性后掛柱啊！各位還有什么高招啊？小妹先謝過了。zhaocy8903(站內(nèi)聯(lián)系TA)用其它純化手段anik(站內(nèi)聯(lián)系TA)有可能是你的his 標(biāo)簽掉了，另一個就是你的鎳柱沒有還原徹底。wjswj(站內(nèi)聯(lián)系TA)曾經(jīng)傻乎乎的用TE緩沖液溶蛋白去掛鎳柱，結(jié)果……后來想想真好笑：）txstbbm(站內(nèi)聯(lián)系TA)這樣呀，不變形的話也可以嘗試做個活性蛋白電泳，然后切膠回收吧!peng5053(站內(nèi)聯(lián)系TA)我建議你做一個正對照，用一個完好的his標(biāo)簽的蛋白去做純化，在通過你的結(jié)果去分析問題到底出在那個地方！tiani_tan(站內(nèi)聯(lián)系TA)用western驗證一下是否有該標(biāo)簽，看一下緩沖液里有沒有能夠和ni結(jié)合的物質(zhì)lsbrc(站內(nèi)聯(lián)系TA)1.首選確定你的His融合是可溶性表達(dá)；
2.確定你的Ni株沒有問題，注意Ni有沒有掉下來，建議對Ni柱進(jìn)行清洗，然后再生。
3.改變Binding Buffer的pH（在不影響活性情況下，建議提高pH可增加Ni的親和力）、鹽濃度、添加Triton、NP40等；
我最后是將組氨酸標(biāo)簽融合到了基因序列的后面jerryqpr(站內(nèi)聯(lián)系TA)1，western檢驗一下你的蛋白是不是有his標(biāo)簽
2，你的鎳柱是不是有問題，是否需要再生了再用
3，你設(shè)計引物加入his標(biāo)簽的時候是否有誤，6個his密碼子不能是一樣的，如果his標(biāo)簽設(shè)計在c端的話很可能這些his沒有表達(dá)出來。ly888lsp(站內(nèi)聯(lián)系TA)1，ORF不完整或者不是預(yù)期的ORF，His沒表達(dá)出來
2，His被空間結(jié)構(gòu)所掩蓋，建議變性后再過柱一只魚ddtt(站內(nèi)聯(lián)系TA)你的蛋白表達(dá)是在包涵體中表達(dá)嗎？是的話那就必須先變性，如果以后要用有活性的蛋白，那你就得進(jìn)行復(fù)性后再用。另外可能是你的鎳沒有掛好。
