DAPI染色原理及使用方法
1.1 激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理LSCM采用激光束作為光源, 通過(guò)共聚焦成像系統(tǒng), 使得只有聚光鏡聚焦到樣品中某個(gè)焦點(diǎn)上所產(chǎn)生的激發(fā)熒光才能成像, 而來(lái)自焦點(diǎn)以外的散射光被小孔或狹縫遮擋, 無(wú)法在顯示器上面顯示熒光信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助成像系統(tǒng), 采集和匯聚每一個(gè)點(diǎn)上的熒光信號(hào), 形成清晰的二維圖像。由于LSCM可以通過(guò)程序控制自動(dòng)調(diào)節(jié)并改變焦平面,所以可以通過(guò)光學(xué)切片改變焦平面而獲得不同切片的圖像, 通過(guò)圖像疊加, 可以獲得樣品的三維結(jié)
構(gòu)。
即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式為C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，和EB相比，對(duì)雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡熒光顯微鏡")觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100 %) 。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。DAPI也常用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細(xì)胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化。
DAPI 是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。它結(jié)合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對(duì)處，一個(gè)DAPI分子可以占據(jù)三個(gè)堿基對(duì)的位置。結(jié)合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強(qiáng)度提高大約20倍，常用與熒光顯微鏡觀測(cè)，根據(jù)熒光的強(qiáng)度可以確定DNA的量。另外，因?yàn)镈API可以透過(guò)完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長(zhǎng)的光線激發(fā)。單獨(dú)DAPI的最大吸收波長(zhǎng)為340nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為488nm；當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)為364nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度只有與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度的1/5，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍約在500nm左右。
利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細(xì)胞固定，使得細(xì)胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白變性，從而使通透性進(jìn)一步加強(qiáng)。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋白先與血清內(nèi)的非特異性抗體結(jié)合，而特異性的抗體由于動(dòng)力學(xué)的關(guān)系可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的反應(yīng)與目的蛋白結(jié)合，這一過(guò)程可以保證抗體識(shí)別的特異性。二抗可以特異性識(shí)別一抗的Fc區(qū)域，利用二抗連接不同的熒光基團(tuán)，就可以在熒光顯微鏡下觀察到不同的熒光，從而顯示目的基因的表達(dá)情況。另外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)由于其較高的敏感性可以顯示出基因表達(dá)的亞細(xì)胞情況(核內(nèi)，核外，膜上以及一些較大的細(xì)胞器上)，所以通常被用來(lái)作為基因定位的方法。
