cDNA的合成實驗原理和操作步驟
一、實驗目的
掌握植物cDNA合成的原理和方法
二、實驗原理
反轉錄酶主要用于體外cDNA的合成。目前最常用的反轉錄酶(reverse transcriptase)
有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它們具有依賴于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子為模板，合成出一條DNA鏈。形成的DNA是與RNA模板互補的，因而反轉錄產生的DNA分子稱之為cDNA。
三、實驗材料、器具及藥品
植物總RNA溶液。 紫外分光光度計、離心機、冰盒、口罩、手套、EP管架、超凈工作臺、移液器、DEPC處理過的槍頭、EP管等。 5×M-MLV
RT Buffer、 2.5mM dNTP mix 、 RNase抑制劑(30U/μL)、M-MLV Reverse
Transcriptase、 Oligo(dT)18 primer、無菌的DEPC水等。
四、實驗步驟
注意：戴手套進行以下操作，嚴防RNase污染。
1．在超凈工作臺上吸取1ml無菌水到EP管中,加入2μl植物總RNA溶液,充分混勻，在紫外分光光度計上測定260,280nm的光吸收值(OD 值),然后計算RNA的濃度,并分析其純度。
分光光度（紫外吸收）法
（1）預熱紫外分光光度計10—20分鐘。
（2）取兩只比色杯，一只裝入1ml H2O溶液，作為空白溶液，用來校正分光光度計零點及調整透光度至100。
（3） DNA純度及濃度測定：
① 取2ul DNA或RNA樣品加入另一比色杯，加dH2O 至1000ul, 混勻。
②將兩只比色杯置分光度計中，調入射光波長，分別用空白溶液調整零點（T為100，OD為0），測定待測樣品液在260nm、280nm、230nm的OD值。
③計算濃度：對于雙鏈DNA 1.0 OD260=50ug/ml,
對單鏈RNA1.0 OD260=40ug/ml。
④測定純度： v純的RNA溶液其OD260/OD280 的比值應介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值應大于2.0。
?RNA樣品OD260/OD280的比值太小，說明有蛋白或苯酚污染。比值大于2.0，則可能被異硫氰酸胍污染。
?OD260/OD230的比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。
純的DNA溶液其OD260/OD280應為 1.8，OD260/OD230應大于2.0。
?OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染，小于1.6時表明有蛋白質或酚污染。
?OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。
2．在DEPC處理過的Ep管中加入約4μg總RNA和1μl 0.5μg/μl的 Oligo(dT)18 primer,小心混勻, 70℃保溫5分鐘,立即浸入冰水中。
3．按次序分別加入下列試劑：
5μl 5×M-MLV RT Buffer
2μl dNTP mix(2.5mM)
1μl RNase抑制劑(30U/μL)
1μl M-MLV Reverse Transcriptase
然后加DEPC水到25μl.
4． 小心混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底， 37℃保溫1小時。
5． 90℃處理5分鐘，冰上冷卻。
6． 用于PCR擴增或-20℃保存備用.
