設(shè)計(jì)cas9條件性基因敲除小鼠
其關(guān)鍵是構(gòu)建帶有兩個(gè)Loxp位點(diǎn)的小鼠，即flox(flanked by loxP)小鼠。
今天我們就來詳細(xì)介紹一下如何設(shè)計(jì)。
共分三步：
第一步，選擇外顯子。
第二步，設(shè)計(jì)sgRNA。
第三步，設(shè)計(jì)SSODN。
聽起來蠻簡單的哈？下面我們詳細(xì)講講。
第一步，選擇外顯子。
1. 盡量選擇敲除所有轉(zhuǎn)錄本共用的外顯子。
我們都知道，真核生物的基因是有外顯子和內(nèi)含子的，利用這些內(nèi)含子和外顯子，一個(gè)基因可以剪接出多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，翻譯后得到多個(gè)蛋白。設(shè)計(jì)條件性敲除的時(shí)候，首先要搞清楚這個(gè)基因有幾個(gè)轉(zhuǎn)錄本，一般敲除所有轉(zhuǎn)錄本共用的外顯子。
2. 該外顯子的堿基數(shù)一定不要是3的倍數(shù)。
這樣才能造成整個(gè)基因編碼的所有蛋白都移碼突變，起到敲除基因的效果。
3. 最好不要選擇第一個(gè)外顯子。
為啥？ 因?yàn)榛蚩赡芾酶浇渌胤降钠鹗济艽a子來起始轉(zhuǎn)錄。這樣你辛苦敲掉了第一個(gè)外顯子，而蛋白可以從別的地方重新開始翻譯。就不能達(dá)到基因敲除的效果。
第二步，設(shè)計(jì)sgRNA。
在選定了外顯子后，就可以開始設(shè)計(jì)sgRNA了。sgRNA的結(jié)構(gòu)如下圖所示。A圖顯示的是平面序列信息。B圖顯示的是三維立體構(gòu)象。sgRNA由兩部分構(gòu)成，即綠色的目標(biāo)序列部分，紅色和藍(lán)色組成的骨架部分。起的作用是指導(dǎo)cas9蛋白在基因組上的特定位置進(jìn)行剪切。所以可見，sgRNA的核心部分主要是綠色部分。所以設(shè)計(jì)sgRNA的關(guān)鍵是選定綠色目標(biāo)序列的位置。針對條件性基因敲除小鼠，一般選擇的區(qū)域是該外顯子相鄰的兩個(gè)內(nèi)含子中。sgRNA的設(shè)計(jì)原則：
1. 在基因組上相似的序列最少。
目的是為了將脫靶效應(yīng)降到最低。
2. 要有NGG。
這是目前最常用的Cas9蛋白識別靶位點(diǎn)所必須的。
這里可以利用許多在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站，找到合適的位點(diǎn)。
引自Cell 156, 935–949, February 27, 2014
第三步，設(shè)計(jì)SSODN（Single-Stranded Oligo Donor）。
SSODN的排列順序是這樣的：同源臂+酶切位點(diǎn)+ loxp位點(diǎn)+同源臂。
1. 同源臂
一般是選擇斷裂點(diǎn)上下游各選40-60bp作為同源臂。具體操作，可以參考下圖。
2. 加入酶切位點(diǎn)
加入一個(gè)酶切位點(diǎn)也是為了方便驗(yàn)證，不加也沒啥。
3. Loxp位點(diǎn)的方向
有一個(gè)點(diǎn)非常重要，就是34bp的loxp位點(diǎn)是有方向的，一定要方向一致，否者當(dāng)你經(jīng)歷了千山萬水拿到小鼠準(zhǔn)備敲除基因的時(shí)候，你會發(fā)現(xiàn)你想敲除的片段只是掉了個(gè)頭，還在那里。這時(shí)候就是想死的心都有了。哈哈，別怪我沒提醒噢。
4. SSODN和sgRNA位于同一條鏈上。
還有一點(diǎn)就是，最好讓SSODN和sgRNA處在同一條鏈上，否則，你的sgRNA還沒有發(fā)揮作用，就已經(jīng)被SSODN給霸占了。這樣的話，人家干活是有情緒的。
引自Cell 154, 1370–1379, September 12, 2013
第四步，行動。
如果你已經(jīng)走到這里，恭喜你，你已經(jīng)完成了設(shè)計(jì)工作，you really can了。
但這才是“萬里長征走完了第一步”。
接下來就是引物設(shè)計(jì)，SSODN的合成，體外轉(zhuǎn)錄，驗(yàn)證sgRNA，顯微注射，F(xiàn)0驗(yàn)證，小鼠雜交等等... ...
這時(shí)，“一大波實(shí)驗(yàn)正在向你靠近”!
