中藥樣品的前處理技術介紹
中藥及其制劑的分析檢驗,一般多采取估計取樣,即將整批中藥抽出一部分具有代表性的供試品進行分析、觀察,得出規律性“估計”的一種方法。對檢測結果進行數據處理和分析,最后做出科學的評價。取樣時應注意以下兩點。
(1)取樣要具有一定的代表性;取樣的基本原則應該是均勻、合理。為使供試品能準確地反映整批中藥及其制劑的質量,取樣時必須抽取具有高度代表性的樣品,以便得出正確的結論。
(2)應嚴格按照規定的取樣方法進行取樣:如取樣的部位不當,操作方法不合理,則會影響到取樣的代表性。對外觀形狀易發生變化者,應分別取樣,并裝入不同的容器內。
1.中藥材和飲片取樣法
(1)抽取樣品前,應核對品名、產地、規格等級及包件式樣,檢查包裝的完整性、清潔程度以及有無水跡、霉變或其他物質污染等情況,詳細記錄。凡有異常情況的包件,應單獨檢驗并拍照。
(2)從同批藥材包件中抽取供檢驗用樣品的原則:藥材總包件數不足5件的,逐件取樣;5～99件,隨機抽5件取樣;100～100件,按5%比例取樣;超過1000件的,超過部分按1%比例取樣;貴重藥材,不論包件多少均逐件取樣。
(3)每一包件至少在2～3個不同部位各取樣品1份;包件大的應從10cm以下的深處在不同的部位分別抽取;對破碎的、粉末狀的或大小在1cm以下的藥材和飲片,可用采樣器(探子)抽取樣品;對包件較大或個體較大的藥材,可根據實際情況抽取有代表性的樣品。每一包件的取樣量:一般藥材抽取100～500g;粉末狀藥材抽取25～50g;貴重藥材抽取5～10g。
(4)將抽取的樣品混勻,即為抽取樣品總量。若抽取樣品總量超過檢驗用量數倍時,可按四分法再取樣。
(5)最終抽取的供檢驗用樣品量,一般不少于檢驗所需用量的3倍,即1/3供實驗室分析用,另1/3供復核用,其余1/3留樣保存。
2.中藥制劑取樣法
各類中藥制劑的取樣量至少為檢測用量的3倍,貴重藥可酌情取樣。
(1)粉狀中藥制劑(散劑或顆粒劑)一般取樣100g,將取出的供試品混勻,然后按四分法從中去除所需供試量。
(2)液體中藥制劑(口服液、酊劑、酒劑、糖漿)一般取樣數量為200ml,同時須注意容器底是否有沉渣,應徹底搖勻,均勻取樣。
(3)固體中成藥(丸劑、片劑、膠囊)一般片劑取量200片,未成片前已制成顆粒者可取100g,丸劑一般取10丸。膠囊按藥典規定取樣不得少于20個膠囊。
(4)注射劑取樣要分為2次,配制后在灌裝、熔封、滅菌前進行一次取樣,經滅菌后的注射劑按原方法進行,分析檢驗合格后可供藥用。已封好的安瓿取樣量一般為200支。
(5)其他劑型的中藥制劑可根據具體情況隨意抽取一定數量作為隨機抽樣。
中藥材分析用樣品制備
(1)超聲提取法
超聲波具有助溶作用,因此可用于樣品中待測組分的提取。超聲提取較冷法速度快,一般僅需數十分鐘即可達到平衡。超聲提取過程中溶劑可能會有一定的損失,所以進行含量測定時,應于超聲振蕩前先稱定重量,提取完畢后,放冷至室溫,再稱重,并補足減失的重量,濾過,取續濾液備用。
超聲提取法簡便,不需加熱,提取時間短,適用于固體制劑中待測組分的提取。應用于藥材粉末的提取時,由于提取組分是由細胞內逐步散出來,速度較慢,加溶劑后先放置一段時間,再進行超聲震蕩提取。
(2)回流提取法
回流提取法是將樣品粉末置燒瓶中,加入一定量的有機溶劑,加熱進行回流提取的方法。在加熱條件下組分溶解度增大,溶出速率加快,有利于提取。回流提取法主要用于固體制劑的提取。提取前應將樣品粉碎成細粉,以利于組分提出。提取溶劑沸點不宜太高,對熱不穩定或具有揮發性的組分不宜采用回流提取法提取。回流提取法提取速度快,但操作稍繁瑣。
(3)連續回流提取法
連續回流提取法適用索氏提取器連續進行提取,操作簡便,節省溶劑,蒸發的溶劑經冷凝流回樣品管,因其中不含待測組分,所以提取效率高。本法應該選用低沸點的溶劑,如乙醇、甲醇等,提取組分對熱應穩定。
(4)萃取法
萃取法是利用溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解度不同,使物質從一種溶劑轉移到另一種溶劑中,經過多次萃取,將測定組分提取出來的方法。萃取法主要用于液體制劑中待測組分的提取分離。
萃取用溶劑應根據待測組分的溶解性來選擇。待測組分應在其中溶解度大,而雜質應在其中溶解度小。溶質在有機相和水相的分配比越大,萃取效率越高。根據相似相容原理,極性較強的有機溶劑正丁醇等適用于提取皂苷類成分,乙酸乙酯多用于提取黃酮類成分,三氯甲烷分子中的氫可于生物堿形成氫鍵,多用于提取生物堿類成分,揮發油等非極性組分則宜用非極性溶劑乙醚、石油醚等提取。
水相的pH值可影響弱酸弱堿性物質在兩相的分配。酸性組分提取的pH值一般應比其pKa低1～2個pH單位,堿性組分提取的pH值則應比其pKa高1～2個pH單位。
酒劑和酊劑在萃取前應先揮去乙醇,否則乙醇可使有機溶劑部分或全部溶解于水中。
(5)水蒸氣蒸餾法
部分具有揮發性并可隨水蒸氣蒸餾出的組分,可采用水蒸氣蒸餾法提取,收集餾出液供分析使用。揮發油、一些小分子的生物堿如麻黃堿、檳榔堿,某些酚類化合物如丹皮酚等可以采用本法提取。用本法提取的組分對熱應穩定。
(6)超臨界流體萃取法
超臨界流體是指當壓力和溫度達到物質的臨界點時,所形成的單一相態,如CO2的臨界溫度為31℃,臨界壓力為7390kPa,當壓力和溫度超過此臨界點的時,CO2便成為超臨界流體。
最常使用的超臨界流體是CO2,因為CO2具有較低的臨界溫度和臨界壓力,同時還具有惰性、無毒、純凈、價格低廉等優點。本法適合于中藥及其制劑中待測組分的提取分離,目前應用日益廣泛。
使用超臨界流體萃取儀提取時,將樣品置于萃取池中,萃取池應恒定在試驗溫度下,用泵將超臨界流體送入萃取池,萃取完畢后,再將溶液送入收集器中。
影響萃取的因素主要有溫度、壓力、改性劑和提取時間等。由于CO2為非極性化合物,因此超臨界CO2對極性組分的溶解性較差。在提取極性組分時,可在超臨界流體中加入適量的有機溶劑作為改性劑,如甲醇、三氯甲烷等。改性劑的種類可根據萃取組分的性質來選擇,加入量一般通過實驗來確定。
黃芪中黃芪甲苷的含量測定
1.色譜條件與系統適用性試驗
以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水(32:68)為流動相;蒸發光散射檢測器。理論板數以黃芪甲苷峰計算應不低于4000。
2.對照品溶液的制備
精密稱取黃芪甲苷對照品適量,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。
3.供試品溶液的制備
取本品中粉約4g,精密稱定,置索氏提取器中,加甲醇40ml,冷浸過夜,再加甲醇適量,加熱回流4h,提取液回收甲醇并濃縮至干,殘渣加水10ml,微熱使溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取4次,每次40ml,合并正丁醇提取液,用氨試液充分洗滌2次,每次40ml,棄去氨試液,正丁醇液蒸干,殘渣加水5ml使溶解,放冷,通過D101型大孔吸附樹脂柱,以水50ml洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30ml洗脫,棄去洗脫液,續用70%乙醇80ml洗脫,蒸干,用甲醇溶解并轉移至5ml量瓶內,加甲醇至刻度,搖勻,即得。
4.測定法
精密量取對照溶液10μ1、20μl,供試品溶液20μl,注入液相色譜儀,測定,以外標兩點法對數方程計算,即得。本品按干燥品計算,含黃芪甲苷(C41H68O14)不得少于0.040%。
超臨界流體萃取技術
超臨界流體萃取是用超臨界流體作為萃取劑,從各種復雜的樣品中,把所需要的組分分離提取出來的一種分離提取技術。超臨界流體萃取技術用于色譜樣品的處理中,可從復雜的樣品中將預測組分分離提取出來,制備成合適于色譜分析的樣品。
超臨界流體的密度與液體相近,與液體一樣很容易溶解其他物質;另一方面,超臨界流體的黏度略高于氣體,溶質在超臨界流體中的擴散系數比在液體中大得多,傳質速率很高,這也有利于物質在超臨界流體中的溶解。同時超臨界流體的表面張力很小,很容易進入樣品基質內,并能保持較高的流速,可使萃取過程在高效、快速和相對經濟的條件下完成。
超臨界流體萃取大致可以分為以下三步:
①預測組分從樣品基體中釋放出來,并擴散溶解到超臨界流體中;
②預測組分從萃取器轉移到收集系統;
③將欲萃取組分與超臨界流體分離。
超臨界流體萃取廣泛應用于從各種香料、草本植物、中草藥中提取有效成分。
目前中藥分析大都采用色譜法,因此兼具分離和分析的功能,樣品經提取后可不經分離直接分析。當有些樣品分析前仍需分離純化和富集時,一般也多采用色譜法,如色譜柱法或固相萃取等方法。固相萃取所用的預處理小柱現已實現商品化,內裝的填料除硅膠、氧化鋁等吸附劑和大孔吸附樹脂外,還有各類化學鍵合相,如C18、氰基、氨基化學鍵合相等,可適于各種極性化學成分的分離。預處理小柱一般為一次性使用,方便,但價格稍貴。
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