實時熒光定量 PCR 原理
實時熒光定量 PCR 技術(shù),是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量的方法。
實時定量 PCR 技術(shù)是在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上,添加了一條標(biāo)記了兩個熒光基團(tuán)的探針。
一個標(biāo)記在探針的5'端,稱為熒光報告基團(tuán)(R);
另一個標(biāo)記在探針的3'端,稱為熒光抑制基團(tuán)(Q)兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu),即5'端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被熒光抑制基團(tuán)吸收或抑制。
當(dāng)二者距離較遠(yuǎn)時,抑制作用消失,報告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng)。熒光信號隨著 PCR 產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)。
實時定量 PCR 方法就是利用此原理,在 PCR 過程中,連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化。當(dāng)信號增強(qiáng)到某一閾值(PCR 反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍)時,此時的循環(huán)次數(shù)(Ct 值)就被記錄下來。
該循環(huán)參數(shù)(Ct 值)和 PCR 體系中起始 DNA 量的對數(shù)值之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的 Ct 值,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)樣品的 Ct值就可以準(zhǔn)確確定起始 DNA 的數(shù)量。
