細胞增殖服務

       四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT方法）是通過快速簡便的顏色反應來檢測細胞存活數量。

       原理：MTT可作為哺乳類動物細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物。當有活細胞存在時，線粒體內琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成藍紫色的針狀甲瓚 （Formazan）結晶并沉積在細胞中，結晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其吸光度OD值，OD值的高低 可間接反映活細胞的數量及其活性。

        優(yōu)點：經濟、靈敏度高，可用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤***敏感性測定等。

        缺點：由于MTT經還原所產生的formazan結晶產物不溶于水，需有機溶劑溶解后才能檢測，這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且有機溶劑對實驗人員也有損害。

     技術服務內容

        1、細胞培養(yǎng)與接種；

        2、處理（如藥物處理等）；

        3、MTT檢測及數據分析；

        4、技術服務報告提交。

     客戶提供：

        詳細的MTT實驗設計，如藥物處理濃度、處理時間等。

     實驗服務報告內容：

        1、MTT實驗原始數據及分析結果，如曲線圖、IC50等；

        2、MTT技術服務所需試劑耗材、儀器設備、實驗方法各一份。

細胞凋亡檢測服務

      細胞凋亡（apoptosis）一般是指機體細胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，發(fā)生的一種程序性細胞死亡(programmed cell death)。細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而 是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。
        根據細胞凋亡的形態(tài)學和生物化學變化，一般常用的檢測方法包括：形態(tài)學檢測，Annexin V 法，線粒體膜勢能的檢測，DNA 片斷化檢測，TUNEL 法，Caspase-3 活性的檢測，TFAR19 蛋白的表達和細胞定位分析。
        

Tunel法檢測細胞凋亡

       TUNEL細胞凋亡檢測 (TUNEL Apoptosis Assay) 是一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡檢測方法。對于待檢測的細胞或組織樣品，經過生物素標記和后續(xù)的DAB顯色等步驟，即可在普通光學顯微鏡下觀察到凋亡 細胞。細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn) 180-200bp的DNA ladder。

        基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin- dUTP)，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結合，zei后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到凋亡的細胞。
 
服務內容
       1.     組織切片/細胞爬片

        2.     常規(guī)TUNEL檢測
        3.     熒光TUNEL試劑盒檢測
        4.     數據整理及結果分析
        *根據客戶需要對細胞核進行熒光染色

客戶須知：
       1.     由客戶提供熒光TUNEL檢測試劑盒

        2.    本公司保證數據的客觀性、準確性，但不保證與客戶預期吻合

提供結果：
       1.     成像圖片（或按客戶需要排列圖片，達到可直接發(fā)表水平）

        2.     實驗詳細流程
        3.     原始數據
        4.     標記后（處理后）的樣本

樣本要求：
       1.     懸浮生長培養(yǎng)細胞的甩片或涂片

        2.     貼壁生長的培養(yǎng)細胞 
        3.     冰凍切片 
        4.     常規(guī)石蠟切片
 

Annexin V-FITC/PI流式法檢測細胞凋亡

        在正常細胞中，***脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發(fā)生凋亡zei早期，膜***脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側，這一變化早于細胞皺縮、染色 質濃縮、DNA片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。Annexin V是一種***脂結合蛋白，與***脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的***脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。***化丙***（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將 Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。

細胞遷移與侵襲

實驗介紹
      將 Transwell 小室放入培養(yǎng)板中，小室內稱上室，培養(yǎng)板內稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分 可以影響到上室內的細胞，應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。
 
      實驗步驟：

      1材料準備：
      可 拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8μm，沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實驗的細胞培養(yǎng)板 24孔板。細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng) 基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結晶紫染液（0.1% （g/ml）PBS結晶紫）
 
      2步驟和流程
      2.1基質膠鋪板：
       用BD公司的Matrigel 1：8（根據細胞產生mmp的量來決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。
 
      2.2制備細胞懸液
 
      ①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
 
      ②消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調整細胞密度至5×105/ml。
 
      2.3接種細胞
 
      ①取細胞懸液100µl加入Transwell小室。
 
      ② 24孔板下室一般加入600µl含20S的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。
 
      ③培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。
 
      2.4結果統(tǒng)計
 
      直接計數法，“貼壁”細胞計數，這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞。
 
      取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。
 
      0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。
 
      400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數。
 
      實驗周期
      1個月
 
      服務周期
      1-2個月
 
      收費標準
      歡迎詢價詳談

流式細胞儀進行細胞周期檢測（PI）

     細胞周期的定義生命 是從一代向下一代傳遞的連續(xù)過程，因此是一個不斷更新、不斷從頭開始的過程。細胞的生命開始于產生它的母細胞的分裂, 結束于它的子細胞的形成，或是細胞的自身死亡。通常將通過細胞分裂產生的新細胞的生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經歷的過程稱為細胞周期。 在這一過程中，細胞的遺傳物質復制并均等地分配給兩個子細胞。

      PI染色的檢測
      PI能夠插入雙鏈DNA中。它被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡的細胞的細胞膜。

      PI單染色的固定方法：
      1．收集細胞（1～5）×106個，500～1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
      2．3ml PBS洗一次。
      3．離心去PBS，加入冰預冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
      4．離心棄去固定液，3ml PBS重懸5min。
      5．400目的篩網過濾1次，500～1000r/min離心5min，棄去PBS。
      6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
      7．流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產生紅色熒光，可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。
 
 
      （1）材料：
      1、PI（e.g.,Cat #537059,Calbiochem,San Diego,CA）
      2、緩沖體系：1×PBS(Ca2+ and Mg2+ free,e.g.,Cat#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鮮小牛血清＋0.1%疊氮鈉

      A、  PI緩沖液
      用緩沖液將PI溶解至終濃度為1mg/ml中，于4℃下密封避光保存1個月。
      B、  PI濃縮液
      用緩沖液將PI溶解至終濃度為500mg/ml，于4℃下密封避光保存。我們已經檢測過將PI濃縮液放置數月后，并無觀察到染色活性的丟失。


      （2）方法：
      將樣品細胞按程序描述的方法用FITC標記的單克隆抗體進行單色染色。
      A、  在zei后的洗滌步驟后，將樣品細胞懸浮于PI緩沖液中，于4℃下密封避光保存以備通過流式細胞儀分析；
      B、  在zei后的洗滌步驟后，如前述將樣品細胞懸浮后備用。如果您想檢測樣品細胞活力，在每一管中加入2μl的PI濃縮液，混勻。將樣品置于4℃下密封避光保存以備流式細胞儀分析。

      服務周期
       20個工作日

      收費標準
      歡迎詢價詳談

聯(lián)系人：曲經理

電話：18910286571

QQ:2099912585

郵箱：quling@ymbio.com

細胞增殖、遷移、周期檢測由廣州廣電計量檢測股份有限公司為您提供，如您想了解更多關于細胞增殖、遷移、周期檢測 報價、型號、參數等信息，歡迎來電或留言咨詢。

注：該產品未在中華人民共和國食品藥品監(jiān)督管理部門申請醫(yī)療器械注冊和備案，不可用于臨床診斷或治療等相關用途。