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當前位置: 睿科集團 應用文獻 全自動固相萃取-高效液相色譜法串聯質譜測定 水中沙星類抗生素藥物殘留

全自動固相萃取-高效液相色譜法串聯質譜測定 水中沙星類抗生素藥物殘留

2018-08-16
  • 其他
  • 沙星類抗生素,喹諾酮
  • 藥物殘留
  • 李建晴,馮小花,董川. 三種喹諾酮類藥物濾紙表面延遲熒光法研究[J]. 光譜學與光譜分析.(2003).
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摘要

1.介紹

沙星類(Quinones,QNs)抗生素(圖-1)是一類人工合成的新型殺菌性抗菌藥物,具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性以及毒副作用小、價格低廉等特點,被大量用于治療和預防水生動物疾病及促生長。但研究表明,所使用的抗生素僅20%~30%被魚類吸收,大部分進入環境中,而這部分抗生素再次進入食物鏈,可能導致養殖環境中病菌耐藥性的產生,導致二次污染。這不僅影響到水產養殖業的健康發展,而且還威脅著生態環境的安全。水樣中殘留喹諾酮類抗生素,通過飲用進入人體,可能對人體肝臟功能造成嚴重損傷。因此,建立水環境中這類藥物的檢測方法尤為重要。目前,喹諾酮類藥物殘留檢測方法,主要包括HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS,另外還有熒光光譜法、毛細管電泳法和酶聯免疫法等。

結構式.png

圖-1. 16種沙星類抗生素的結構式

本實驗選擇MCX陽離子交換柱進行富集、凈化,超高壓液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)聯用技術檢測,建立了環境水樣中高靈敏的分析方法,該方法有望應用于水產養殖中。

關鍵字:全自動固相萃取;高效液相色譜-串聯質譜;抗生素

2.儀器、試劑以及耗材

Reeko Fotector Plus全自動固相萃取儀(睿科)

MCX 固相萃取柱(Oasis,200 mg/6 mL)

高效液相色譜:(HPLC)Agilent 1260,質譜檢測器(MS)Agilent 6410

氮氣吹干裝置:Reeko AutoEVA-60全自動平行濃縮儀

甲醇,乙腈(TEDIA 色譜純);甲酸,氨水(優級純)。

3.樣品制備與凈化

3.1固相萃取凈化條件

全自動固相萃取儀睿科Fotector Plus 60位
固相萃取柱MCX(Waters,200 mg/6 mL)
活化甲醇
淋洗pH=4.0 的甲酸水溶液
洗脫5%的氨水甲醇溶液

3.2 富集凈化

依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱,備用。取純凈水樣200mL,如為加標樣品,請加入標準品(100 μL,100 ppb),加入EDTA-MCIlvaine緩沖溶劑(50 mL,0.1 mol/L)調節水環境的pH為4,以5mL/min的速率經固相萃取小柱富集后;用甲酸水溶液(pH=4.0)10 mL以10 mL/min速率淋洗;氣推后用10 mL的5%氨水甲醇以1.0mL/min的速率洗脫。收集的樣品在25 ℃,5 psi條件下濃縮至近干,流動相乙腈-水溶液(10:90,v/v,0.1 %甲酸)定容至1.0mL,供LC/MS-MS分析。全自動固相萃取方法見圖-2。

1.png

圖-2. Fotector Plus水中沙星抗生素固相萃取方法

4.液質檢測條件

4.1 色譜柱條件

2.png

4.2 MRM參數

表-1. 16種抗生素的串聯質譜檢測參數

16種抗生素的串聯質譜檢測參數.jpg

4.3 16種沙星類抗生素的保留時間譜圖

5.jpg

圖-3. 16種喹諾酮標準物質的MRM色譜圖(5 ng/mL,進樣量10 μL)

5.樣品測試

5.1基質效應驗證

取純凈水樣,按照上述的樣品處理步驟后,氮吹至近干,加入標準使用液(1ppm,20 μL),定容成1mL,供LC/MS-MS檢測。如果基質加標濃度準確,則可以直接用標準曲線對樣品進行定量;如果不準確,請使用含有基質的工作曲線進行定量。

選擇定量離子的峰面積作為縱坐標,濃度作為橫坐標,做相關曲線,曲線為線性回歸,各點權重相等,擬合出工作曲線,要求R2>0.99;此曲線兩周需要重新配置一次。

5.2 樣品基質加標測試

對桶裝純凈水和生活廢水進行加標實驗,加標濃度為低濃度(25 ng/L)、中濃度(50 ng/L)和高濃度(100 ng/L),結果如表-2所示:除了恩諾沙星和司帕沙星在76.9%~79.4%外,大部分的加標回收率在82.5%~114.2 %之間,RSD 1.5%~16.6%。該方法能夠實現對水樣中16種喹諾酮抗生素進行檢測。

表-2不同水樣的加標回收率

不同水樣的加標回收率.jpg

5.3 不同類型固相萃取柱對沙星類化合物的富集效果

取純凈水為樣品,加標的質量濃度分別為50 ng/L,按照上述方法,進行4平行樣測定,考察該方法的不同固相萃取柱的回收率和重現性,分析結果如圖-4所示:純凈水中抗生素的平均回收率分布在65.00%-91.38%(HLB),71.21%-152.28%(MAX)和77.41 % -123.21 %(MCX)。HLB回收率普遍偏低,MAX柱中沙星的回收率偏高,培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超過了140 %,而且MAX柱需要在水樣中加入氫氧化鈉,容易造成水樣中金屬離子的水解沉淀,容易造成管路的堵塞。相比之下MCX柱的平行性比HLB柱和MAX好,回收率大部分在90 %-110%之間,除了恩諾沙星回收率偏低,只有77.41 %。

7.jpg

圖-4. 三種柱子的回收率對比

6. 結果與討論

6.1 對于16種沙星類化合物在水中的富集方法,應考慮實驗過程中基質對化合物檢測的干擾。此步的干擾不僅來自于水樣中雜質干擾,同時商業化的固相萃取小柱,使用的色譜級溶液等等都存在干擾雜質,因此需要進行基質效應確認,以避免前處理富集過程中存在基質效應。

6.2 氮吹濃縮過程中應控制吹干程度,不可過分干燥。

6.3 對于沙星類的兩性化合物,在pH=7.0左右時,主要以帶負電荷的形式存在水溶液中,此時進行富集,固相小柱無法對目標物進行吸附。因此需要進行pH調節至4.0左右,使其成為帶銨根的正離子,利于下一步進行陽離子交換柱富集。

6.4 淋洗時采用甲酸酸化的水溶液,利于將固相萃取小柱中殘留的EDTA除去,避免其在后續的洗脫液中干擾沙星類化合物的檢測。

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