摘要

碳水化合物的分析檢測是很多產品的質控指標，選擇合適的HPLC方法可使碳水化合物的分析變得簡單、快速。其中色譜柱和檢測器的選擇是方法建立的兩個關鍵因素，決定了碳水化合物分析的分離條件以及該條件下適合的檢測對象。

前言

碳水化合物種類繁多，分子大小差異也很大，有小分子的單糖，也有幾千幾萬的聚糖甚至幾百萬的多糖。另外每種糖都有許多異構體。這些復雜的結構給碳水化合物的分析檢測帶了一定的困擾。本文參照德國KNAUER公司利用AZURA液相系統采用不同檢測器對蜂蜜中糖含量的分析研究，分別從色譜柱和檢測器的特性及選擇方案為需要建立碳水化合物HPLC分析方法的研究者提供可行性的參考方案。

色譜柱的選擇

色譜柱，色譜分離的核心，不同類型色譜柱直接決定了碳水化合物的分離效果。分離碳水化合物常用的色譜柱有：氨基柱、糖分析柱（聚合物基質柱）、凝膠柱和C18柱。這些色譜柱分離原理和分離條件不同，所以有著不同的分離效果，適應不同的分析對象，詳見下表。

 碳水化合物常用分析色譜柱

1.       凝膠柱

樣品進入凝膠柱后，在一定孔徑的凝膠顆粒中擴散，按照分子篩效應，大分子較快洗脫出小分子較慢洗脫出來。由于這樣的分離原理，限制了相同或相近分子量的碳水化合物不能實現很好分離，所以凝膠柱常用于大分子的多糖或者高聚糖的分離檢測。

2.           C18柱

C18柱，實驗室最常見色譜柱，價格低廉，使用注意事項少。碳水化合物一般易溶于水，極性較高，所以在C18柱上沒有很好的保留。但是可以通過衍生化提高碳水化合物的疏水性，搭配紫外檢測器，就可以使用C18柱進行分析檢測。

3.       氨基柱

氨基柱在分析碳水化合物時采用的是HILIC模式，這樣的分離模式決定了氨基柱比較適合較小分子糖的分離，可適用于分離同時含有單糖、二糖、三糖等不同聚合度的混合糖分子的樣品。氨基柱的鍵合相氨丙基易水解，所以氨基柱的使用壽命較短，使用注意事項相對較多。酸性或高比例水相條件會加速水解，因此氨基柱應避免在酸性或者高水相的流動相中使用。當樣品顯酸性的時候，可在流動相中略微添加少許氨來提高氨基柱柱效和壽命。

4.       糖分析柱

糖分析柱簡稱糖柱，采用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質，金屬離子對為官能團，二者通過磺酸基鍵合作為填料。分離時，低交聯度的樹脂允許糖的透過，并且按尺寸大小進行分離表現為尺寸排阻作用，同時碳水化合物上的羥基與樹脂的金屬對離子形成結合體而被保留，表現為配位體交換作用。由于這種特殊的分離機制決定了糖柱更擅長分析單糖，對于結構復雜、分子量大的碳水化合物分離效果稍差。德國諾爾糖分析柱特殊工藝不僅可以適用于聚合度小于8的糖分析，還可適用于糖醇及有機酸類物的分析檢測。

糖柱分離條件簡單，樣品制備工作量小，可直接使用水洗脫，因此糖柱很容易建立分離糖類物質的方法。但是糖柱特殊的基質所以使用時常需要較高柱溫（60~80℃），一般液相柱溫箱只能達到65℃，而諾爾AZURA系統液相的柱溫箱可達到85℃，無需額外配置柱溫箱就可達到所需色譜條件進行糖檢測，非常簡便快速。

檢測器的選擇

碳水化合物本身沒有很好的發色基團，無法直接使用常規紫外檢測器，只能使用通用性檢測器比如RID、ELSD或者柱前衍生化后采用紫外檢測器進行檢測。

1.       柱前衍生紫外檢測

柱前衍生紫外檢測是利用具有強紫外吸收的物質對多糖完全水解后產生的單糖成分進行衍生，然后通過C18柱和紫外檢測器對其衍生物進行分離檢測，工作量較大，這種方法的優點是紫外檢測器在檢測單糖衍生物可以達到比RID和ELSD檢測糖時更低的檢測限（LOD），同時該法更適合對由多種單糖組成比較復雜的酸性雜多糖分析，分離模式多樣，對實驗條件要求不高，分離效果重現性好。缺點是衍生化條件的建立及操作較繁瑣。

2.       示差折光檢測器

示差折光檢測器（RID）是一款通用型檢測器，其原理是連續檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數的差值。不需要對糖進行特別處理就可以直接檢測，不受糖的修飾類型及分子量大小等條件限制。檢測條件簡單，只需要檢測池溫度穩定（各生產廠家工藝不同，穩定性各有差異，推薦使用KNAUER示差折光檢測器，），不需對檢測器檢測參數進行過多的摸索。

由于RID特殊的檢測原理，流動相的成分也會有明顯的折光響應，改變流動相成分會影響樣品池與參比池折光率差值，因此RID不能使用梯度洗脫。一般搭配能夠在等度洗脫條件下可實現很好分離效果的色譜柱，比如糖分析柱。 RID使用之前必須用流動相對參比流路進行沖洗平衡，諾爾的RID相比其他廠家的RID只需一小時就能快速將參比池平衡好進行測定。總體來說，使用RID分析糖的優點是樣品前處理簡單、方法建立簡單，分析種類不限，缺點是該檢測器對多數物質的靈敏度低，通常不用于痕量分析；受環境溫度、流動相組成等波動的影響較大，不適合梯度洗脫。

3.       蒸發光散射檢測器

與示差折光檢測器相同，ELSD也是通用型檢測器。不同于紫外和熒光檢測器，ELSD的響應不依賴于樣品的光學特性，任何揮發性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響。樣品前處理簡單。因為是去溶劑檢測，所以ELSD可用于梯度洗脫，但是流動相中不可以含有不揮發的緩沖鹽。水相比例高的流動相汽化比較困難，會使基線噪音增大，導致分析靈敏度降低。所以常搭配氨基柱來進行檢測分析。

綜合來說，ELSD靈敏度較高（圖1，ELSD與RID響應值對比圖，諾爾提供）、樣品前處理簡單、分析種類廣。確定是方法建立比較困難，容易產生廢氣對人體有害。

結論

基于諾爾采用不同檢測器對蜂蜜中糖含量的分析研究（圖2，ELSD測定各產品色譜圖；圖3，RID測定各產品色譜圖），ELSD檢測器雖具有更高的檢測靈敏度，但是操作繁瑣，線性范圍窄；柱前衍生繁瑣耗時長，而 RID線性范圍廣，可以直接對未稀釋的樣品進行定性分析，簡便快速。同時德國諾爾示差折光檢測器具有平衡時間短、基線穩定的特點，建議做糖應首選 RID。色譜柱的選擇時應充分了解樣品中糖的種類、聚合度等信息然后再選擇合適的色譜柱進行分析檢測。